Ultraempfindlicher und visueller Nachweis des menschlichen Norovirus-Genotyps GII.4 oder GII.17 mithilfe von CRISPR

Virology Journal Band 19, Artikelnummer: 150 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Integration von CRISPR-Cas12a-Sensoren mit isothermer Signalverstärkung kann genutzt werden, um kostengünstige, wegwerfbare und hochempfindliche Assays für die Diagnostik menschlicher Krankheitserreger zu entwickeln.

Es wurden RT-RAA-Cas12a-vermittelte Echtzeit- oder Endpunkt-Fluoreszenz- und Lateral-Flow-Strip-Assays (LFS) zum direkten Nachweis des Norovirus (NOV)-Genotyps GII.4 oder GII.17 untersucht.

Die Ergebnisse zeigten, dass unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz- und LFS-Assay NOV GII.4 oder GII.17 nachweisen konnte, indem er auf das virale Protein-1-Gen abzielte. Unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz- und LFS-Assay kann NOV GII.4 oder GII.17 spezifisch nachweisen, ohne dass es zu einer Kreuzreaktivität mit anderen verwandten Viren kommt. Die untere Nachweisgrenze konnte innerhalb von etwa 30–40 Minuten 0,1 Kopien/μl erreichen, und die Ergebnisse wurden mit einem Ultraviolettlicht-Illuminator oder auf einem LFS ohne komplexe Ausrüstung visualisiert. Darüber hinaus bot unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz- und LFS-Assay eine visuelle und schnellere Alternative zum Echtzeit-RT-PCR-Assay mit 95,7 % und 94,3 % positiver Vorhersageübereinstimmung und 100 % negativer Vorhersageübereinstimmung.

Zusammengenommen hätte unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Ansatz ein großes Potenzial für die Point-of-Care-Diagnostik von NOV GII.4 und/oder GII.17 in ressourcenbeschränkten Umgebungen.

Humane Noroviren (NOVs) gelten mittlerweile als Hauptursache für die Mehrzahl aller nichtbakteriellen Gastroenteritis [1]. NOVs sind eine Gruppe von RNA-Viren, die sowohl bei ansonsten gesunden Kindern als auch bei Erwachsenen Symptome wie akutes Erbrechen und Durchfall verursachen können, die im Allgemeinen 48 Stunden anhalten. NOVs sind hochinfektiös, da bereits wenige Partikel Krankheiten auslösen können und infizierte Personen große Mengen an Viren ausscheiden [2, 3]. NOVs werden hauptsächlich durch Kontakt mit kontaminierten Lebensmitteln und Wasser infolge des direkten oder indirekten Kontakts mit NOV-infizierten menschlichen Fäkalien auf den Menschen übertragen [4] oder in Aerosolen, die durch Erbrechen infizierter Personen entstehen [5]. Aufgrund der hohen Infektiosität von NOVs und ihrer Fähigkeit zur effizienten Übertragung wurden weltweit Ausbrüche von NOVs in geschlossenen Gemeinschaftseinrichtungen, einschließlich Krankenhäusern und Pflegeheimen, gemeldet und erfordern daher Interventionsmaßnahmen zur Reduzierung aggressiver Infektionen [6].

Humane Noroviren verfügen über eine immense genetische Vielfalt mit zehn verschiedenen Genogruppen (GI-GX) und mindestens 48 identifizierten Genotypen [7]. Es ist bekannt, dass die Genogruppen GI, GII und GIV von NOVs mit Infektionen beim Menschen in Zusammenhang stehen. Unter den etwa 21 Genotypen des NOV GII war der Genotyp GII.4 im letzten Jahrzehnt für die Mehrzahl der klinischen Fälle von Durchbruchinfektionen von NOVs verantwortlich [8]. Kürzlich ist ein neuartiger Genotyp von GII.17 von NOVs aufgetaucht und hat sich schnell ausgebreitet, um in einigen Teilen Asiens zum dominierenden NOV-Stamm zu werden, was das Risiko weiterer Ausbrüche birgt [9]. Abgesehen von nur wenigen Berichten über eine wirksame antivirale Behandlung beim Menschen [10] ist derzeit kein zugelassener NOVs-Impfstoff für Menschen verfügbar [11]. Daher spielt eine schnellere und frühere Erkennung einer NOV-Infektion eine wichtige Rolle bei der Erleichterung einer frühzeitigen Intervention, Behandlung und Infektionsprävention, was wiederum das Übertragungsrisiko des infektiösen Virus verringern kann.

Der aktuelle Goldstandard für den Nachweis von NOVs sind molekulare Techniken, einschließlich der reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), der eingebetteten RT-PCR und der Echtzeit-RT-PCR [12]. Unter diesen Methoden wird die Echtzeit-RT-PCR aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität sowie des geringen Risikos einer Verschleppungskontamination häufig zum Nachweis oder zur Diagnose einer NoV-Infektion eingesetzt. Derzeit zeigen verschiedene kommerziell erhältliche Echtzeit-RT-PCR-Assays die Empfindlichkeit der Echtzeit-RT-PCR bei 10–50 Genomkopien/Reaktion für NoV GI und 1–300 Genomkopien/Reaktion für NoV GII [13]. Allerdings erfordert die Echtzeit-RT-PCR-Methode in der Regel hochentwickelte Ausrüstung und hochqualifiziertes Personal und hat eine durchschnittliche Reaktionszeit von etwa 2 Stunden, was alles nicht für eine einfache, schnelle und Point-of-Care-Methode (POC) geeignet ist ) molekularer Assay zur Diagnose einer NOV-Infektion in ressourcenbeschränkten Gebieten für den Routinenachweis. In einer aktuellen Studie haben Sun et al. präsentierte eine papierbasierte kolorimetrische Methode zum Nachweis und zur Unterscheidung der Genotypen GII.4 und GII.17 von NOVs [14]. Allerdings benötigt der Test mit dieser Methode relativ viel Zeit (~ 3 h), der Nachweisbereich ist zwischen 2,6 fM und 0,5 pM begrenzt und daher im Vergleich zur RT-PCR weniger empfindlich [14]. Umgekehrt hat das RNA-gesteuerte Nukleinsäure-Nachweissystem auf Basis von Cluster-Nukleinsäuren, das aus den regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR) und ihren CRISPR-assoziierten (Cas) Nukleasen besteht, aufgrund der hervorragenden Schnelligkeit, Empfindlichkeit und Spezifität kürzlich ein beträchtliches Potenzial gezeigt nutzen die POC-Molekulardiagnostik der nächsten Generation für infektiöse Krankheitserreger [15,16,17]. Derzeit wurde die Wirksamkeit mehrerer Versionen von Cas-Nukleasen, einschließlich Cas12a, Cas12b, Cas13a und Cas14, sowohl in In-vitro- als auch in-vivo-Assays untersucht [18,19,20,21]. Unter diesen Nukleasen ist Cas12a (früher Cpf1) eine Endonuklease der Klasse II vom Typ V. Cas12a, das eine RuvC-Nukleasedomäne enthält, wird von einer einzelnen CRISPR-RNA (crRNA) geleitet, die eine T-reiche Protospacer-Adjacent-Motiv-Sequenz (PAM) enthält, um doppelsträngige DNA (dsDNA) an einer bestimmten Stelle zu spalten, oder ohne PAM, um eine unspezifische ssDNA-Spaltung durchzuführen in trans in vitro [18]. Darüber hinaus wurde die Kombination von Cas12a-Nukleasen mit Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) oder Reverse-Transkription-RPA (RT-RPA) gründlich untersucht, um ein DNA-Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)-System zu entwickeln, das die Empfindlichkeit und Spezifität des Nukleinsäurenachweises deutlich erhöht [ 18].

In dieser Studie wurde durch gezieltes Targeting des viralen Protein-1-Gens (VP1) der Genotypen GII.4 und GII.17 von HNOVs eine Kombination aus Reverse-Transkriptions-Rekombinase-unterstützter Amplifikation (RT-RAA) mit CRISPR-Cas12a, die als RT-RAA bezeichnet wird, entwickelt -Cas12a ist in der Lage, wenige Kopien von Nukleinsäuren (RNA) mit einem viel höheren Grad an Spezifität nachzuweisen, ohne dass teure Instrumente erforderlich sind. Darüber hinaus wurde unsere RT-RAA-Cas12a-vermittelte Fluoreszenz- und Lateral-Flow-Strip-Methode (LFS) durch das Testen von 80 klinischen Proben weiter validiert und erzielte äußerst konsistente Ergebnisse mit denen der herkömmlichen RT-PCR-Methode. Zusammenfassend demonstrieren wir einen CRISPR-Cas12a-vermittelten Assay für den schnellen, ultraempfindlichen, spezifischen und visuellen, instrumentenfreien POC-Nachweis von NOVs des Genotyps GII.4 oder GII.17.

Insgesamt wurden 80 archivierte Stuhlproben mit Ct-Werten unter 30 (< 30 Ct) von Personen gesammelt, die NOV-bezogene klinische Symptome zeigten, von denen 40 bzw. 30 Proben positiv auf den NOV-Genotyp GII.4 bzw. GII.17 getestet wurden und 10 Proben, einschließlich GII. 2, GII. 3 und GII. 6 nach einer früheren Methode [22]. Diese in dieser Studie verwendeten Proben wurden zwischen Januar 2016 und Dezember 2020 vom Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention (NCDC) gesammelt. Die ethische Genehmigung für diese Studie wurde von der Ethikkommission des NCDC eingeholt.

FAM-TTATTATT-Quencher (ssDNA FQ), FAM-TTATTATT-Biotin (ssDNA FB) und Sonden wurden von GENEWIZ Inc. (Suzhou, China) generiert. Die Oligonukleotide aller in dieser Studie verwendeten Primer wurden von Sangon Biotech (Shanghai, China) synthetisiert und in Tabelle 1 aufgeführt. Das RT-RAA-Nukleinsäureamplifikationskit wurde von Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co., Ltd (Wuxi, China) erworben. NEbuffer 2.1 und Cas12a wurden von New England Biolabs (MA, USA) gekauft. Das LFS wurde von Tiosbio (Nanjing, China) gekauft.

Ganze Genomsequenzen verschiedener Stämme des NOV-Genotyps GII.4 oder GII.17 wurden aus der NCBI-Datenbank wiederhergestellt und mit ClustalW abgeglichen. Basierend auf dem Alignment-Ergebnis wurde eine spezifische Konsensusregion des viralen Protein-1-Gens (VP1), die den Sequenzen 4991–5380 entspricht, als Ziel bestimmt (Abb. 1). Das DNA-Fragment der Zielsequenz wurde synthetisiert und in das Plasmid pBluscript II SK (+) (Sangon, Shanghai, China) eingefügt (Abb. 1). Das resultierende pBluscript-NOV wurde in Escherichia coli TOP10-Zellen transformiert, um den rekombinanten Stamm TOP-NOV zu konstruieren. Anschließend wurde das pBluscript-NOV mit dem TIANprep Mini Plasmid Kit (Tiangen Biotech, Peking, China) extrahiert und mit Sac I linearisiert. Das lineare pBluscript-NOV wurde als Matrize für die zu erzeugende In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) verwendet NOV-RNA-Standard unter Verwendung des IVT T7-Kits (TaKaRa, Dalian, China). Das IVT-Reaktionsgemisch bestand aus 5 μl 10 × Transkriptionspuffer, 5 μl jeder NTP-Lösung, 1 μl RNase-Inhibitor, 5 μl T7-RNA-Polymerase, 6,5 μl RNase-freiem Wasser und 12,5 μl linearem pBluscript-NOV Plasmid isoliert und 2 Stunden bei 39 °C inkubiert. Schließlich wurde die RNA-Konzentration in Nanogramm mithilfe der folgenden Formel in die RNA-Kopienzahl umgerechnet: RNA-Kopienzahl = [M (ng/μL) × 6,02 × 1023]/(N × 109 × 340), wobei sich M auf die RNA bezieht Konzentration quantifiziert durch ein Spektrophotometer (Metash Instruments, Shanghai, China), N bezieht sich auf die Länge der RNA.

Visualisierung von Primern für die Reverse-Transkriptions-Rekombinase-unterstützte Amplifikation (RT-RAA) und crRNA-Spacerstellen in der Gensequenz des Zielvirusproteins 1 (VP1) des NOV-Genoms. RT-RAA-Primer werden durch rote Rechtecke angezeigt. crRNAs sind so programmiert, dass sie speziell auf das VP1-Gen der Noroviren (NOV) GII.4 und GII.17 abzielen

Vier crRNAs mit unterschiedlichen Nukleotiden von crRNA-Spacersequenzen, die auf die hochkonservierte Region des VP1-Gens abzielen, wurden bestimmt und mithilfe des Basic Local Alignment Search Tool weiter auf die Spezifität jeder crRNA für den NOV-Genotyp GII.4 oder GII.17 untersucht. Darüber hinaus wurden die 21 Nukleotide von 5′-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3′ für die crRNA-Stammsequenz verwendet und dienten als Bindungsgerüst für Cas12a. Die Herstellung von crRNA wurde mit dem folgenden Schritt durchgeführt. Die in Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotide zur Herstellung des crRNA-Präparats wurden von GENEWIZ chemisch synthetisiert. (Suzhou, China) hergestellt und geglüht. Die resultierenden doppelsträngigen DNAs (dsDNA) wurden durch In-vitro-Transkription unter Verwendung des IVT T7-Kits weiter transkribiert. Die Transkriptionsreaktion umfasste 5 μl 10 × Transkriptionspuffer, 5 μl jeder NTP-Lösung, 1 μl RNase-Inhibitor, 5 μl T7-RNA-Polymerase, 9 μl RNase-freies Wasser und 10 μl getemperte dsDNA und wurde bei 39 °C inkubiert °C für 2 Stunden. Die resultierenden crRNA-Produkte wurden mittels Phenol-Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung gereinigt und die Konzentration der crRNA wurde mit einem Spektrophotometer bestimmt.

Die Leistung von RT-RAA wurde durch den Vergleich von drei Faktoren, bestehend aus verschiedenen Primern, der Spezifität und der Empfindlichkeit des Assays, bewertet. Die RT-RAA-Reaktionsmischung umfasste 25 μL Reaktionspuffer V, 2 μL jedes Primers (10 μM), 16,5 μL ddH2O, 2 μL Standard-RNA und 2,5 μL 280 mM Magnesiumacetat. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 20 Minuten bei 39 °C in das vorgeheizte isotherme Axxin T8-Instrument gestellt. Anschließend wurden die RT-RAA-Produkte mit einem gleichen Volumen von 50 μl Phenol/Chloroform behandelt, einer Agarosegelelektrophorese (2 %) unterzogen und schließlich unter ultraviolettem (UV) Licht bewertet.

Der RT-RAA-Cas12a-vermittelte Assay wurde unter Verwendung von 5 μl RT-RAA-Produkten in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl sowie 45 μl der CRISPR-Cas12a-Reaktionsmischung, die 5 μl 10 × NEBuffer enthielt, durchgeführt 2.1, 1 μL 100 nM crRNA, 1 μL 1 μM Cas12a, 0,5 μL RNase-Inhibitor (40 U) und 2 μL 1 μM ssDNA-Reporter, 35,5 μL RNase-freies Wasser. Anschließend wurden die Reaktionen im vorgeheizten isothermen Axxin T8-Instrument 15 Minuten lang bei 39 °C durchgeführt, wobei alle 10 Sekunden Fluoreszenzsignale gesammelt wurden (ssDNA-FQ-Substrate = λex: 485 nm; λem: 535 nm) und mit einem UV-Licht-Illuminator sichtbar gemacht wurden und LFS mit ssDNA FB als Substraten.

Die Spezifität des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Assays wurde durch Testen jeder RNA-Probe mit einer Konzentration von 200 Kopien/μl von anderen gastrointestinalen Viren, einschließlich humanem Rotavirus (HRV), Astrovirus (HAtV) und Enterovirus 71 (HEV71), durchgeführt. Als Kontrolle in dieser Studie wurden 10 verschiedene Proben verwendet, die positiv auf jedes Testvirus getestet wurden, sowie 10 Nicht-GII.4- oder GII.17-Proben.

Um die Empfindlichkeit des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Assays zu bewerten, wurde ein Konzentrationsgradient von RNA-Standardproben, der auf 200, 100, 10, 1, 0,5, 0,1 und 0,05 Kopien/µL eingestellt wurde, als Vorlage verwendet RT-RAA-Reaktion. Alle Volumina des Cas12a-vermittelten Tests betrugen 50 µL, wie oben beschrieben. Jeder Reaktionsprozess wurde dreimal wiederholt und die Ergebnisse wurden mittels Fluoreszenz und LFS analysiert.

Die Gesamt-RNA von 80 Proben, jeweils 200 µl klinische Lösung, wurde manuell mit dem BeaverBeads™ Viral DNA/RNA Kit BEAVER, Suzhou, China, extrahiert und automatisch mit einem automatischen Nukleinsäureextraktionsgerät (bioPerfectus Technologies, Jiangsu, China) durchgeführt. jeweils. Der RT-PCR-Nachweis auf NOV-Nukleinsäuren klinischer Proben wurde mit dem NOV-Testkit (bioPerfectus Technologies, Jiangsu, China) in einem ABI 7500 (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit einem ersten Schritt der reversen Transkription bei 48 °C für 30 Minuten, gefolgt von 95 °C für 15 Sekunden, 35 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden und 53 °C für 1 Minute durchgeführt.

Jede Probe wurde in mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt. Die statistische Analyse der Daten zur Endpunktfluoreszenz wurde mit Prism 8 (GraphPad-Software, Version 8.0.1) durchgeführt und statistische Unterschiede wurden mit dem Students-t-Test bewertet. Der ungepaarte zweiseitige t-Test wurde angewendet, um die Unterschiede zwischen Gruppen zu untersuchen, und der Schwellenwert zur Definition der Signifikanz basierte auf dem p-Wert < 0,05.

Wir haben zunächst RT-RAA-Primer für den RT-RAA-Assay optimiert, da das optimale Primerpaar eine entscheidende Rolle für hohe Produktivitäten der dsDNA unter optimierten Bedingungen spielte. Die hochkonservierte Region des VP1-Gens des NOV-Genoms wurde als crRNA-Zielstelle basierend auf dem Alignment der gemeldeten NOV-Genome GII.4 und GII.17 bestimmt, die eine Sequenzhomologie von 92,95 % aufwiesen. In dieser Studie wurden basierend auf der Sequenz des VP1-Gens verschiedene Primerpaare und crRNA entworfen, um optimale Primerpaare und crRNA auszuwählen (Abb. 1). Die Amplifikationseffizienz von vier Primerpaaren wurde bei RNA-Standardkonzentrationen von 1 × 105 Kopien/μL bei 39 °C für 20 Minuten mit dem RT-RAA-Kit untersucht und verglichen. Wie in Abb. 2a gezeigt, erzeugten nur NOV-F2/NOV-R1-Primerpaare klare Banden mit der erwarteten Größe von 369 bp bei 1 × 105 Kopien/μl. Anschließend wurde die NOV-F2/NOV-R1-Spezifität unter Verwendung anderer viraler RNA-Proben als Matrize mit einer Konzentration von 1 × 105 Kopien/μl validiert. Abbildung 2b zeigte, dass die NOV-F2/NOV-R1-Primerpaare nicht mit anderen relevanten Viren, einschließlich HRV, HAtV und HEV71, kreuzreagierten. Darüber hinaus wurden Reihenverdünnungen des RNA-Standards im Bereich von 1 × 102 bis 1 × 105 Kopien/μL angewendet, um die Empfindlichkeit der RT-RAA-Reaktion zu bewerten. Abbildung 2c zeigte, dass NOV-F2/NOV-R1 bei Konzentrationen von 1 × 104 Kopien/μL eine einzelne und klare Bande erzeugte. Aus diesen Daten schlossen wir, dass NOV-F2 und NOV-R1 das effizienteste Primerpaar waren und daher für die nachfolgenden Experimente verwendet wurden.

Bewertung von Primerpaaren für die Reverse-Transkriptions-Rekombinase-unterstützte Amplifikation (RT-RAA). a Die optimalen Primerpaare für RT-RAA wurden mit dem RNA-Standard von NOV GII.4 bzw. GII.17 bei 1 × 105 Kopien/μL bewertet. Spur 1: NOV-F1/NOV-R1; Spur 2: NOV-F2/NOV-R1; Spur 3: NOV-F1/NOV-R2; Spur 4: NOV-F2/NOV-R2. b Die Spezifität des RT-RAA-Assays wurde mit drei gastrointestinalen Viren durchgeführt, darunter humanes Rotavirus (HRV), Astrovirus (HAtV) und Enterovirus 71 (HEV71), und die Ergebnisse wurden durch Agarose-Elektrophorese nachgewiesen. NC, Negativkontrolle. c Die Empfindlichkeit des RT-RAA-Assays wurde unter Verwendung der Konzentration des RNA-Standards von NOV GII.4 und GII.17 im Bereich von 1 × 105 bis 1 × 102 Kopien/μl durchgeführt

Um die Machbarkeit eines RT-RAA-Cas12a-vermittelten Echtzeit- oder Endpunkt-Fluoreszenzassays zum Nachweis der NOVs GII.4 oder GII.17 zu bewerten, wurden vier Grundreagenzien des Assays identifiziert: crRNA, Cas12a, Ziel-DNA, und ssDNA FQ-Reporter. Vier Reaktionssysteme mit verschiedenen Reagenzien wurden vorbereitet und untersucht. Nach 20-minütiger Inkubation bei 39 °C erzeugte nur das Reaktionssystem, das RT-RAA-Produkte, crRNA-, Cas12a- und ssDNA-FQ-Reporter enthielt, ein helles Fluoreszenzsignal (Abb. 3a), wobei die Fluoreszenzintensität mit zunehmender Spaltungszahl kontinuierlich zunahm von ssDNA FQ-Reportern. Bemerkenswerterweise wurde im Reaktionsgefäß Nr. 1 bei Beleuchtung mit einem UV-Lichtbeleuchter ein Farbumschlag von Blau nach Grün beobachtet (Abb. 3b).

Machbarkeitsanalyse eines RT-RAA-Cas12a-basierten Assays für den Nachweis von NOVs GII.4 oder GII.17. Echtzeit- (a) und Endpunktfluoreszenz (b) des RT-RAA-Cas12a-basierten Assays wurden in Gegenwart oder Abwesenheit basischer Reagenzien 30 Minuten lang bei 39 °C untersucht. Die Bilder der Röhrchen wurden nach 30-minütiger Inkubation unter ultraviolettem (UV) Licht aufgenommen

Die entsprechende crRNA erleichterte die Basenpaarung des crRNA-Samens mit dem Zielstrang der dsDNA und führte zu hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit. In dieser Studie wurden vier crRNAs entworfen und unter Verwendung der Oligonukleotide durch In-vitro-Transkription hergestellt. Die durch den Cas12a-crRNA-Zielkomplex induzierte Spaltungseffizienz wurde bewertet. Abbildung 4a, b zeigte, dass die Effizienz der durch crRNA1, crRNA2-2 und crRNA3 vermittelten Cas12a-Trans-Spaltung einen signifikanten statistischen Unterschied in der Fluoreszenzintensität im Vergleich zur negativen Gruppe aufwies, was darauf hindeutet, dass crRNA1 ohne PAM-Sequenz auch die Cas12a-Spaltungsaktivität aktivieren kann herausragende Spezifität und eliminieren somit die Notwendigkeit einer PAM-Sequenzbeschränkung. Frühere Studien zeigten jedoch, dass die PAM-Sequenz ein Schlüsselfaktor bei der unspezifischen Kollateralspaltung von Cas12a zur Ziel-dsDNA ist und dass crRNA1 ohne PAM-Sequenz daher die Unsicherheit des Nachweissystems erhöhen kann [23]. Interessanterweise zeigte die crRNA2-2-vermittelte Gruppe im Vergleich zu anderen crRNA-induzierten Gruppen die schnellste Fluoreszenzreaktion und das Fluoreszenzsignal war nach 3 Minuten gesättigt. Darüber hinaus wurde eine crRNA-vermittelte Umwandlung eines grünen Fluoreszenzsignals in ein blaues Fluoreszenzsignal in der mit crRNA1, crRNA2-2 oder crRNA3 behandelten Gruppe unter einem UV-Licht-Illuminator im Vergleich zur mit crRNA2-1 behandelten und nicht mit crRNA behandelten Gruppe beobachtet (Abb. 4c) und die crRNA2-2-vermittelte Gruppe erzeugte im Vergleich zu anderen crRNA-behandelten Gruppen unter UV-Bestrahlung eine intensive blaue Fluoreszenz. Daher wurde crRNA2-2 in den nachfolgenden RT-RAA-Cas12a-Experimenten verwendet.

Screening der optimalen crRNA für einen RT-RAA-Cas12a-basierten Assay. Die RT-RAA-Cas12a-basierten Echtzeit- (a) und Endpunkt-Fluoreszenzwerte (b) wurden nach 15-minütiger bzw. 14-minütiger Inkubation mit 30 nM unterschiedlicher crRNA bei 39 °C gemessen. Für jede Probe wurden drei Wiederholungen durchgeführt. Fehlerbalken beziehen sich auf die Standardabweichungen bei drei Wiederholungen (n = 3). Die statistische Analyse wurde angewendet, um den Unterschied zwischen den Testgruppen und NC zu bewerten. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. NC, Negativkontrolle. c Visualisierung der RT-RAA-Cas12a-basierten Detektion unter ultraviolettem (UV) Licht

Um eine bessere Leistung des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Assays zu erreichen, wurde die Auswirkung der crRNA-Konzentration auf den RT-RAA-Cas12a-vermittelten Assay durch Festlegung des Verhältnisses von crRNA2-2 zu Cas12a (1:1) untersucht. Wie in Abb. 5a gezeigt, gab es eine sehr gute lineare Beziehung in der Signalintensität bei einer crRNA2-2-Konzentration zwischen 5 und 20 nM, was bestätigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit von Cas12a mit der crRNA2-2-Konzentration skalierte. Im Gegensatz dazu blieben die Fluoreszenzintensitäten bei weiteren Anstiegen der crRNA2-2-Konzentration zwischen 20 und 30 nM konstant. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass ein Überschuss an Cas12a- und crRNA2-2-Gemischen zu einer crRNA-unabhängigen Spaltung führen kann [24], was darauf hinweist, dass ein Überschuss an crRNA möglicherweise ein erhöhtes Risiko für falsch positive Ergebnisse mit sich bringt. Daher wurden 20 nM crRNA2-2-Konzentrationen für unseren RT-RAA-Cas12a-vermittelten Assay für das folgende Nachweissystem angewendet. In ähnlicher Weise wurden im RT-RAA-Cas12a-vermittelten LFS-Assay, um den potenziellen Einfluss der Menge an crRNA2-2 auf die falsch-positiven Antworten nur in Abwesenheit der Zielamplifikationsprodukte zu bewerten, verschiedene Konzentrationen von crRNA2-2 von 5 bis 30 verwendet bis 30 nM wurden angewendet und die Reaktion wurde auf LFS sichtbar gemacht. Wie erwartet hatte der Assay eine kurze Laufzeit von 30–40 Minuten, und bei verschiedenen crRNA2-2-Konzentrationen zwischen 5 und 30 nM wurden keine falsch positiven Antworten erhalten (Abb. 5b), was auf eine crRNA2-2-Konzentration von 20 nM schließen lässt kann bei der folgenden RT-RAA-Cas12a-vermittelten LFS-Detektion nützlich sein, um die hohe Nachweisgrenze sicherzustellen.

Die Auswirkung verschiedener crRNA2-2-Konzentrationen auf die Leistung von RT-RAA-Cas12a-basierten Tests. a Die auf RT-RAA-Cas12a basierenden Fluoreszenzwerte wurden nach 15-minütiger bzw. 10-minütiger Inkubation mit 0, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 nM crRNA2-2 bei 39 °C gemessen. Es gab einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz bei einer Konzentration von crRNA2-2 zwischen 5 und 20 nM, während die Fluoreszenzintensitäten bei einem weiteren Anstieg von crRNA2-2 von 20 auf 30 nM nahezu konstant blieben. b Um zu testen, ob hohe Konzentrationen von crRNA2-2 zu falsch positiven Ergebnissen führen können, wurden verschiedene crRNA2-2-Konzentrationen mithilfe von Lateral-Flow-Strip-Auslesungen (LFS) nur in Abwesenheit der Amplifikationsprodukte im RT-RAA-Cas12a-basierten Assay untersucht. Bei hohen Konzentrationen von crRNA2-2 wie 20 nM und 30 nM wurden keine falsch positiven Ergebnisse gefunden

Die Spezifität wurde anhand anderer viraler Genomproben bestimmt. Um das von Cas12a bei Verwendung von Fluoreszenz oder Lateral Flow erzeugte Signal zu untersuchen, wurde die Leistung der RT-RAA-Cas12a-vermittelten Auslesung bei identischen Produkten durch Visualisierung von Fluoreszenzsignalen in Echtzeit und am Endpunkt sowie durch Lateral Flow bei 0, 3 untersucht , 6 und 10 Minuten wurden überwacht. Wie in Abb. 6a gezeigt, zeigten die RT-RAA-Cas12a-vermittelten Echtzeit-Fluoreszenzdaten eine überlegene Leistung mit hoher Spezifität ohne Kreuzreaktionen mit Nicht-GII.4- oder GII.17-Zielen und waren innerhalb von < 1 Minute nachweisbar. In ähnlicher Weise zeigten die Daten beim Vergleich der Endpunktfluoreszenz nach 14 Minuten Reaktionszeit eindeutig einen effizienten und spezifischen Nachweis der NOVs GII.4 oder GII.17 (Abb. 6b). Insbesondere wurde das grüne Fluoreszenzsignal des Endpunkts unter UV-Licht beobachtet, während das blaue Fluoreszenzsignal in anderen Proben beobachtet wurde, was darauf hinweist, dass die Visualisierungsergebnisse mit bloßem Auge unter Verwendung der einfachen Ausrüstung beobachtet wurden (Abb. 6c), was den Vorgang vereinfacht der Probenbehandlung. Unterdessen zeigte unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Lateral-Flow-Strip-Assay eine hohe Spezifität für den Nachweis von NOV GII.4 oder GII.17 und lieferte eine leicht zu interpretierende qualitative Anzeige für das Vorhandensein oder Fehlen des Zielvirus (Abb. 6d).

Spezifität und Empfindlichkeit des RT-RAA-Cas12a-basierten Fluoreszenz- und Lateral-Flow-Strip-Assays (LFS). a–d Spezifität der RT-RAA-Cas12a-vermittelten Echtzeit- und Endpunkt-Fluoreszenz und LFS-Assay wurde mit humanem Rotavirus (HRV), Astrovirus (HAtV) und Enterovirus 71 (HEV71) bei Konzentrationen von 200 Kopien/μl durchgeführt . Visualisierung des Cas12a-Assays auf NOV VP1 in Echtzeit (a), Endpunkt (b), unter ultraviolettem (UV) Licht (c) und durch LFS (d). (e–h) Die Sensitivität wurde mit einer Gradientenkonzentration von NOV-Standard-RNA im Bereich von 200 bis 0,05 Kopien/μl durchgeführt. Visualisierung des Cas12a-Assays auf NOV VP1 in Echtzeit (e), Endpunkt (f), unter ultraviolettem (UV) Licht (g) bzw. durch LFS (h). Für jede Probe wurden drei Wiederholungen durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von drei Replikaten an (n = 3). Die statistische Analyse wurde eingesetzt, um den Unterschied zwischen den Erkennungsgruppen und NC zu bewerten. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. NC, die Negativkontrolle. Strg ist die Steuerleitung. Test bezieht sich auf die Testzeile

Als nächstes wurde eine Reihe verdünnter NOV-Standard-RNAs aufgezeichnet, um die analytische Fähigkeit von RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz und LFS zu testen. „Wie in Abb. 6e dargestellt, wurde die positive Fluoreszenzausbeute mit einer allmählichen Steigerung beobachtet, als die Konzentration der Ziel-RNA von 0,05 auf 200 Kopien/μL anstieg.“ Abbildung 6e–g zeigt deutlich, dass die RT-RAA-Cas12a-vermittelte Fluoreszenz sowohl bei der Echtzeit- als auch bei der Endpunkt-Fluoreszenzdetektion konsistent bis zu ~ 0,1 Kopien/μL der NOVs GII.4- oder GII.17-RNA-Ziele nachweisen konnte. Darüber hinaus war das positive Signal mit bloßem Auge und durch LFS leicht sichtbar, was darauf hindeutet, dass der RT-RAA-Cas12a-vermittelte LFS-Assay ein hohes Maß an Empfindlichkeit für NOVs GII.4- oder GII.17-RNA aufwies. Insbesondere das RT-RAA-Cas12a-vermittelte LFS leistet einen großen Beitrag zur praktischen Anwendung, insbesondere zur schnellen Erkennung vor Ort. Daher stellte unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz- und LFS-Assay durch die Ausrichtung auf das VP1-Gen von NOVs GII.4 oder GII.17 eine schnelle, hochempfindliche und spezifische Methode für den Nachweis von NOVs GII.4 oder GII.17 an der Nukleinsäure dar Ebene.

Die manuelle RNA-Extraktion für 80 identifizierte klinische Proben mit verarbeiteten Magnetkügelchen dauert etwa 2 Stunden, was praktisch mit einer einfachen Magnetabscheiderausrüstung in einer ressourcenarmen Umgebung durchgeführt werden kann und teure Ausrüstung überflüssig macht. Insgesamt 80 RNA-Extrakte wurden im RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Assay getestet. Um die Nachweisgenauigkeit sicherzustellen, wurde jede RNA-Probe in drei unabhängigen Experimenten gemessen. Wie in Tabelle 2 gezeigt, stimmten die Ergebnisse unserer RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Messungen in hohem Maße mit denen der RT-PCR-Methode zum Nachweis der NOVs in insgesamt 80 Stuhlproben überein. Die positive Vorhersageübereinstimmung der Cas12a-vermittelten Fluoreszenz und des LFS-Assays für RT-RAA-Proben im RT-PCR-Assay betrug 95,7 % bzw. 94,3 %, während die negative Vorhersageübereinstimmung 100 % betrug. Die hohe Übereinstimmung zwischen unseren Ergebnissen aus RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz und LFS-Auslesungen könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass Cas12a durch die Führung von crRNA spezifisch an das Zielgen binden und in Gegenwart von durch RT amplifizierten VP1-Zielgenen aktiviert werden kann -RAA, was zum durch Cas12a vermittelten Schneiden der ssDNA-FQ- oder ssDNA-FB-Reportermoleküle führt. Darüber hinaus wurden, wie in Abb. 7 dargestellt, klinische Proben mit einem RT-RAA-Cas12a-vermittelten LFS-Assay untersucht, einschließlich der NOV-Genotypen GII0.2, GII0.3 oder GII0.6, es wurden jedoch nur GII.4 und GII.17 nachgewiesen von LFS.

Die Ergebnisse repräsentativer klinischer Proben, einschließlich Norovirus (NOV)-Genotyp GII.2, GII.3, GII.4, GII.6 und GII.17, unter Verwendung des RT-RAA-Cas12a-basierten Lateral-Flow-Strip-Assays für NOV GII.4 oder GII.17-Erkennung

Beim Menschen wird seit mehr als zwei Jahrzehnten berichtet, dass Norovirus-GII.4-Viren für die meisten Magen-Darm-Infektionen verantwortlich sind [3]. Kürzlich wurde über das Auftreten des neuartigen Norovirus-Genotyps GII.17 berichtet, der seit der Wintersaison 2014 und 2015 den pandemischen Stamm GII.4 als Hauptursache für Gastroenteritis-Ausbrüche in China und Japan ablöste [9]. Eine frühzeitige Diagnose ist entscheidend, um die weitreichende Ausbreitung dieses Virus zu stoppen. Die Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) stellt derzeit die am häufigsten eingesetzte Methode zur Früherkennung der Krankheitserreger dar; RT-PCR, die den dringenden Bedarf an spezieller Laborausrüstung und geschultem Fachpersonal verdeutlicht, ist jedoch nicht auf schnelle POC-Diagnosetests anwendbar. Die Einschränkungen aktueller Nachweisansätze stellen ernsthafte Hindernisse für die Echtzeitüberwachung und frühere Erkennung des hochinfektiösen Erregers in ressourcenarmen Umgebungen dar, mit dem Ziel, die Übertragung in der Gemeinde und im Krankenhaus zu reduzieren. Daher besteht ein dringender Bedarf an einer schnellen, einfachen, kostengünstigen und effizienten Diagnosemethode auf Nukleinsäurebasis, die für den routinemäßigen POC-Einsatz in ressourcenarmen Umgebungen geeignet ist.

In dieser Studie stellten wir einen einfachen, schnellen und hochspezifischen RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Assay zum Nachweis der NOVs GII.4 und/oder GII.17 vor. Unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Assay kombiniert eine vollständig isotherme Amplifikation von RNA-Proben mit optimierten crRNAs mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität, um einen robusten Nachweis von NOVs GII.4 und/oder GII.17 zu ermöglichen. Insbesondere können die Nachweisergebnisse des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Assays mit mehreren Methoden ausgewertet werden, darunter mit bloßem Auge unter UV, LFS sowie Echtzeit- und Endpunktfluoreszenz. Die Anwendung fluoreszenzbasierter Echtzeit-Auslesungen liefert hochspezifische, empfindliche Tests, die frei von Kontaminationen sind. Darüber hinaus ist die Ergebnisinterpretation auf der Grundlage der bloßen Augen- und LFS-Erkennung unabhängig von hochentwickelter Ausrüstung und professionellen Technikern, was ein vorteilhaftes Werkzeug für POC- und ressourcenarme Umgebungen darstellt. Außerdem wurden bei Endpunkt-Fluoreszenz-Auslesungen Fluoreszenzintensitäten während der Amplifikationsreaktion erfasst, und es ist möglich, durch Bestimmung von Endpunkt-Fluoreszenzdaten eine semiquantitative Detektion zu ermöglichen.

Der RT-RAA-Cas12a-vermittelte LFS-Assay wurde mit dem ssDNA FB Reporter durchgeführt, dessen beide Enden mit FAM und Biotin markiert waren [23, 25]. Für die negative Probe wurde der Goldpartikel-Anti-FAM-Antikörper zunächst ausreichend mit dem ssDNA-FB-Reporter konjugiert und dann von Streptavidin an der Kontrollbande eingefangen. Im Gegensatz dazu wurde bei der positiven Probe bei der Spaltung des ssDNA-FB-Reporters das resultierende freie FAM mit Goldpartikel-Anti-FAM-Antikörper konjugiert und der Komplex an der Testbande akkumuliert, und die Akkumulation des Komplexes wurde verringert entsprechend am Kontrollband. Daher hing die Stärke der Testbande von der Spaltungseffizienz ab und war umgekehrt proportional zu der der Kontrollbande.

Im Vergleich zu unserer zuvor berichteten Nachweismethode für NOV GII.4-Nukleinsäure basierend auf RT-RAA-Cas12a [23] war dieser neuartige Assay hochspezifisch und äußerst empfindlich für den Nachweis von NOVs GII.4 oder GII.17. Interessanterweise könnte im Vergleich zu unserer vorherigen Veröffentlichung [23] in dieser Studie die Einführung des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Endpunkt-Fluoreszenzassays für eine einfache Auslesung durch ein tragbares, batteriebetriebenes Fluoreszenzlesegerät vorzuziehen sein oder das tragbare UV-Licht in ressourcenarmen Umgebungen. Darüber hinaus kann der Assay in < 15 Minuten Echtzeit-Amplifikationsergebnisse generieren, wodurch die Notwendigkeit entfällt, die Reaktionsfläschchen nach der Reaktion zu öffnen, wodurch der Arbeitsablauf vereinfacht und das Kontaminationsrisiko minimiert wird. Diese ultrahohe Empfindlichkeit könnte auf die hohe Amplifikation von RT-RAA unter Verwendung optimaler RT-RAA-Primer sowie auf die effiziente Endonukleaseaktivität des Ziels zurückzuführen sein, die durch Cas12a durch das optimierte Konzentrationsverhältnis von crRNA zu Cas12a gesteuert wird. Darüber hinaus zeigte dieser neuartige Assay angesichts der sequenzbasierten stringenten Erkennung von Cas12a eine hohe Spezifität beim Nachweis von NOVs GII.4 und/oder GII.17 ohne Kreuzreaktion mit anderen Virussequenzen, was sein Potenzial als wirksames Werkzeug für hervorhebt Krankheitsdiagnostik.

Um die Gültigkeit und das klinische Potenzial des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Assays zu bewerten, wurden aus NOVs in Stuhlproben extrahierte virale RNAs verwendet, die mit 95,7 % und 94,3 sehr konsistente Nachweisergebnisse mit denen der RT-PCR-Methode erzielten % positive Vorhersageübereinstimmung und 100 % negative Vorhersageübereinstimmung. Die falsch negativen Proben des RT-RAA-Cas12a-vermittelten Fluoreszenz- und LFS-Assays wurden zur Überprüfung ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die falsch-negativen Ergebnisse auf Reagenzien oder Verbrauchsmaterialien zurückzuführen sind, darunter das lyophilisierte Reagenz und LPS für den RT-RAA-Assay. Daher muss die Zuverlässigkeit von Reagenzien oder Verbrauchsmaterialien weiter verbessert werden. Bezeichnenderweise kann unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Assay die Arbeitsschritte mit einer tragbaren Kammer auf Mikrofluidikbasis weiter reduzieren und rationalisieren. Insbesondere durch die Integration von luftgetrockneten spezifischen Primern, Fluoreszenzsonden, RT-RAA und Cas12a sowie flüssigen Reagenzien für die Nukleinsäureextraktion, verpackt in Stick-Packs, kann eine schnelle und einfache molekulardiagnostische Plattform für den Einsatz in verwendet werden Umgebungen mit geringen Ressourcen wie Flughäfen, örtliche Notaufnahmen und Kliniken [26]. Darüber hinaus kann durch die Kombination der mikrofluidischen Multiplex-Detektionstechnologie [27] unser RT-RAA-Cas12a-vermittelter Assay durchgeführt werden, um gleichzeitig den Multiplex-Nachweis der Probe zu ermöglichen und so NOVs und andere Pathogeninfektionen zu erkennen und zu unterscheiden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Kombination des CRISPR-Cas12a-unterstützten Nukleinsäurenachweises, der RT-RAA-vermittelten isothermen Amplifikation und des Lateral-Flow-Streifens ein praktischer RT-RAA-Cas12a-vermittelter Fluoreszenz- oder LFS-Assay zum Nachweis des NOVs GII etabliert wurde. 4 und/oder GII.17. Aufgrund seiner Geschwindigkeit, Einfachheit und geringen Kosten ist der RT-RAA-Cas12a-vermittelte Fluoreszenz- oder LFS-Assay vielversprechend für die Früherkennung von NoVs GII.4 und/oder GII.17, insbesondere in Umgebungen mit geringen Ressourcen.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.

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Diese Studie wurde von der Natural Science Foundation of China (Nr. 81973531), dem Fundamental Research Project der Shenzhen Science and Technology Innovation Commission (Nr. 20200812211704001), der Medical Scientific Research Foundation der Provinz Guangdong (Nr. A2019502) und der Scientific finanziert Forschungsprogramm finanziert von der Bildungsabteilung der Provinz Shaanxi (Nr. 22JC010) und dem Wissenschafts- und Technologieprogramm der staatlichen Verwaltung für Marktüberwachung und -verwaltung (Nr. 2021MK107).

School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an, 710021, Volksrepublik China

Weidong Qian, Jie Huang und Ting Wang

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Cheng Fan & Jie Kang

Abteilung für Dermatologie, Huazhong University of Science and Technology Union Shenzhen Hospital, Shenzhen, 518052, Volksrepublik China

Qian Zhang

Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo, 315010, Volksrepublik China

Yongdong Li

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Si Chen

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WQ, YL, SC, QZ: Konzeptualisierung, Schreiben, Rezension und Bearbeitung. JH, TW und YL: Software, Untersuchung, Validierung, Datenerfassung. YL, CF und QZ: Analyse und Interpretation. TW und JK: Methodik, Supervision. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yongdong Li oder Si Chen.

Die Sammlung klinischer Proben wurde vom Ningbo Center for Disease Prevention and Control genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Qian, W., Huang, J., Wang, T. et al. Ultraempfindlicher und visueller Nachweis des menschlichen Norovirus-Genotyps GII.4 oder GII.17 mithilfe des CRISPR-Cas12a-Assays. Virol J 19, 150 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01878-z

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Eingegangen: 04. Juni 2022

Angenommen: 01. September 2022

Veröffentlicht: 17. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01878-z

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Ultraempfindlicher und visueller Nachweis des menschlichen Norovirus-Genotyps GII.4 oder GII.17 mithilfe von CRISPR