Mitochondriale DNA ist ein Ziel der HBV-Integration

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 684 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Hepatitis-B-Virus (HBV) kann sich in das Genom infizierter Zellen integrieren und zur Hepatokarzinogenese beitragen. Die Rolle der HBV-Integration bei der Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC) bleibt jedoch unklar. In dieser Studie wenden wir einen Hochdurchsatz-HBV-Integrationssequenzierungsansatz an, der eine empfindliche Identifizierung von HBV-Integrationsstellen und die Auszählung von Integrationsklonen ermöglicht. Wir identifizieren 3339 HBV-Integrationsstellen in gepaarten Tumor- und Nicht-Tumor-Gewebeproben von 7 Patienten mit HCC. Wir entdecken 2107 klonal erweiterte Integrationen (1817 in Tumor- und 290 in Nicht-Tumorgewebe) und eine signifikante Anreicherung klonaler HBV-Integrationen in mitochondrialer DNA (mtDNA), die vorzugsweise in den oxidativen Phosphorylierungsgenen (OXPHOS) und der D-Loop-Region auftritt. Wir stellen außerdem fest, dass HBV-RNA-Sequenzen unter Beteiligung der Polynukleotidphosphorylase (PNPASE) in die Mitochondrien von Hepatomzellen importiert werden und dass HBV-RNA möglicherweise eine Rolle im Prozess der HBV-Integration in mtDNA spielt. Unsere Ergebnisse legen einen möglichen Mechanismus nahe, durch den die HBV-Integration zur HCC-Entwicklung beitragen könnte.

Eine chronische Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein Hauptrisikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC). Im Vergleich zu gesunden Personen haben Patienten mit chronischer Hepatitis B (CHB) ein bis zu 100-fach höheres Risiko, an HCC zu erkranken, das mit etwa 780.000 Todesfällen pro Jahr die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit ist1,2. Integrierte virale DNA wurde in 85–90 % der HBV-bedingten HCCs nachgewiesen, und ihr Vorhandensein in Tumoren, die sich in der nicht zirrhotischen Leber von Kindern oder jungen Erwachsenen entwickeln, untermauert die Rolle der viralen DNA-Integration bei der Hepatokarzinogenese3,4,5. 6,7. Die Integration von HBV-DNA in das Wirtsgenom kann zu chromosomaler Instabilität, Insertionsmutagenese, Deregulierung der Genexpression des Wirts und der Produktion mutierter viraler Proteine ​​wie verkürzter Oberflächen- und HBx-Proteine ​​mit bekannten onkogenen Eigenschaften führen8,9. Obwohl die Insertionsstellen der HBV-DNA zufällig im gesamten Wirtsgenom verteilt zu sein scheinen, hat der jüngste Einsatz von Next-Generation-Sequencing-Ansätzen (NGS) zur Identifizierung der HBV-Integrationsanreicherung in bestimmte krebsauslösende Gene geführt, darunter TERT, MLL4, CCNE1 und CCNA2, in Tumorgeweben7,10,11,12,13,14,15,16. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass wiederkehrende Veränderungen der Kopienzahl in krebsauslösenden Genen mit einer entfernten Virusintegration verbunden sein können16. Obwohl eine beträchtliche Anzahl von Fällen untersucht wurde, werden bekannte krebsbedingte Gene nur bei einem kleinen Teil der HBV-bedingten HCCs durch die HBV-Integration verändert. Zahlreiche Studien haben auch gezeigt, dass bestimmte genomische Elemente, wie repetitive Sequenzen, DNA-Sequenzen für nicht-kodierende RNAs und Retrotransposons, von der HBV-Integration betroffen sind7,11,12,14,17,18,19. Eine Studie in Hongkong, die HBV-positive HCC-Zelllinien analysierte, zeigte, dass die Expression eines spezifischen chimären HBx-LINE1-Transkripts eine tumorfördernde Funktion hat, wobei ein großer Teil der untersuchten HCCs dieses Transkript exprimierte17. Dennoch wurde die HBx-LINE1-Expression in einer großen Serie HBV-bedingter HCCs europäischer Patienten nicht bestätigt20.

Trotz der Fortschritte bei der Forschung zur HBV-DNA-Integration bleiben viele Schlüsselaspekte unklar. Insgesamt könnte die Entwicklung alternativer Nachweismethoden für die HBV-Integration dazu beitragen, bessere Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die am durch die HBV-Integration ausgelösten krebserzeugenden Prozess beteiligt sind.

Durch die Anwendung einer Hochdurchsatz-HBV-Integrationssequenzierungsmethode (HBIS) konnten wir in dieser Studie eine Anreicherung der Virusintegration in mitochondrialer DNA (mtDNA) sowohl aus Tumor- als auch Nicht-Tumor-Lebergeweben von HCC-Patienten feststellen. Darüber hinaus haben wir HBIS und RNASeq auf Mitochondrien angewendet, die aus HBV-induzierten HepAD38-Zellen gereinigt wurden, und mehrere HBV-Integrationen in mtDNA sowie HBV-Mitochondrien-Fusionstranskripte nachgewiesen. Alle mitochondrialen Integrationen in Tumorgewebe wurden klonal erweitert und betrafen sowohl die mitochondrialen Gene der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) als auch die D-Loop-Region. Wir fanden auch heraus, dass HBV-RNA-Sequenzen in die Mitochondrien von Hepatomzellen importiert werden und dass Polynukleotidphosphorylase (PNPASE) am Import viraler Transkripte beteiligt sein könnte.

Insgesamt wurden 297 Integrationsbibliotheken aus dem Tumorgewebe von sieben Patienten mit HBV-bedingtem HCC und gepaartem angrenzendem Nicht-Tumor-Lebergewebe erstellt, das für sechs der sieben Patienten verfügbar war (Tabelle 1). Die Bibliotheken wurden mithilfe einer Modifikation der von Cohn et al. entwickelten Integrationssequenzierungsmethode generiert. um das Integrationsprofil von HIV-1 in CD4 + T-Zellen zu untersuchen21. Wir bezeichnen die in diesem Artikel verwendete Methode als Hochdurchsatz-HBV-Integrationssequenzierung (HBIS) (Abb. 1).

Durch die Anwendung von HBIS wurden HBV-Integrationsstellen durch semi-nested ligationsvermittelte PCR aus Wirts-DNA (durch Ultraschall fragmentiert, A-tailed und an asymmetrische DNA-Linker ligiert) und die Verwendung von Vorwärts- oder Rückwärtsprimern, die für verschiedene HBV-Genome spezifisch sind, wiederhergestellt Regionen. Zielsequenzen wurden weiter angereichert, indem eine verschachtelte PCR mit Vorwärts- oder Rückwärts-MiSeq-HBV-Primern und Vorwärts- oder Rückwärts-MiSeq-pLinkern durchgeführt wurde, die alle einen Illumina-Adapter für das Annealing der Oberfläche von Durchflusszellen enthielten. Die mit dem Adapter ligierten Fragmente wurden durch PCR mit den Illumina-Primern Index 1 und Index 2 angereichert und die PCR-Produkte wurden einer Hochdurchsatz-Paired-End-Sequenzierung unterzogen. Die Lesevorgänge wurden auf ein Hybridgenom ausgerichtet, das die Referenzgenome human GRCh38.p10 (GenBank-Zugang: GCA_000001405.25) und HBV (GenBank-Zugang: NC_003977) enthielt.

Bei den 7 untersuchten Patienten wurden insgesamt 3339 HBV-Integrationsstellen nachgewiesen (Ergänzungsdaten 1): 2913 Integrationen in Tumor- und 426 in Nicht-Tumor-Gewebeproben. Die durchschnittliche Anzahl der Integrationsstellen im Tumor- und angrenzenden Nicht-Tumorgewebe betrug 416 ± 387 bzw. 71 ± 56 (P = 0,054, Student-t-Test). Alle untersuchten Patienten zeigten eine HBV-Integration, mit durchschnittlich 257 Integrationen pro Patient. Darüber hinaus wurden in allen untersuchten Tumor- und Nicht-Tumor-Gewebeproben HBV-Integrationsstellen nachgewiesen, wobei jede Stelle durch mindestens drei Paired-End-Messungen gestützt wurde.

Wie in früheren Studien21,22,23 gezeigt, ist es durch die Kopplung zufälliger DNA-Fragmentierung (Erzeugung eindeutiger Linker-Ligationsstellen) mit Paired-End-Sequenzierung (die eine genaue Identifizierung sowohl der Integrationsstelle als auch des fragmentierten Endes ermöglicht) möglich, klonal erweiterte Integrationen zu identifizieren ( identische Integrationsstellen mit unterschiedlichen Fragmentierungsenden, die sich aus der klonalen Expansion eines einzelnen Integrationsereignisses ergeben) und einzelne Integrationen (eindeutige Integrationsstellen mit einem einzigen fragmentierten Ende). Daher ermöglicht die HBIS-Methode, die die Aufzählung identischer viraler Integrationsstellen ermöglicht, die Identifizierung klonal erweiterter Integrationen. Wir schätzten, dass es sich bei 2107 (63 %) der 3339 erkannten HBV-Integrationsstellen um klonal erweiterte Integrationen handelte. Von den 2107 klonalen Integrationen wurden 1817 (86,2 %) in Tumorgeweben und 290 (13,8 %) in Nicht-Tumorgeweben gefunden. Allerdings war der Anteil klonal erweiterter Integrationsbruchpunkte in Nicht-Tumorgeweben signifikant höher [290/426 (68 %) gegenüber 1817/2913 (62,4 %); P = 0,025, Z-Test] als in Tumorgewebeproben, wenn die Gesamtzahl der Integrationen berücksichtigt wurde. Obwohl die Größe der einzelnen Klone bei Tumoren zwischen 3 und 3253 und bei Nicht-Tumor-Gewebeproben zwischen 3 und 376 schwankte, war die mittlere Größe der Klone aus ersteren ähnlich der der Klone aus letzteren (14,8 ± 125,3 gegenüber 18,3 ± 35). ; P = 0,589, Student-t-Test). Daher wiesen die untersuchten Tumoren sowohl einen deutlich höheren Anteil kleiner Klone auf [Klongröße ≤100: 1795/1817 (98,8 %) gegenüber 281/290 (96,8 %); P = 0,008, Z-Test] und eine deutlich höhere Anzahl einzelner Integrationsstellen [1096/2913 (37,6 %) gegenüber 136/426 (31,9 %); P = 0,022] als Nichttumorgewebe. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu zuvor berichteten Ergebnissen16, was möglicherweise auf die begrenzte Anzahl der untersuchten Tumoren und auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass alle analysierten Tumoren (a) histologisch gut differenziert waren (Edmondson-Steiner-Grad I–II, ES GI- GII)24, (b) zeigte Niveaus der HBV-Replikation, die denen in passenden Nicht-Tumor-Gewebeproben vergleichbar waren (Tabelle 2), und (c) exprimierte Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid (NTCP), den Eintritts-HBV-Rezeptor, wenn auch in geringeren Mengen als Nichttumorgewebe (P = 0,028, Student-t-Test) (Abb. 2). Durch die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, die Virusreplikation und -reinfektion zu unterstützen, können gut differenzierte Tumorzellen daher im Laufe der Zeit anfällig für das Auftreten neuer HBV-Integrationsereignisse sein.

Die Expression des NTCP-Gens wurde in den sechs Nicht-Tumor- und sieben Tumor-Lebergeweben mittels qRT-PCR bewertet. NTCP wurde in allen analysierten Tumoren exprimiert, allerdings in geringeren Mengen als in Nicht-Tumorgeweben. Die Ergebnisse werden als fache Änderung relativ zu den NTCP-Expressionsniveaus in Nicht-Tumorgeweben ausgedrückt und auf die GAPDH-Expression normalisiert. Die Messungen wurden doppelt durchgeführt und die Ergebnisse sind der Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten (n = 3). Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. Ungepaarter Student-t-Test, P = 0,028.

Die erkannten HBV-Integrationsstellen waren zufällig über das gesamte Genom verteilt und die Monte-Carlo-Simulation ergab keinen Hotspot25. Allerdings zeigte die Analyse der Verteilung der HBV-Bruchpunkte über einzelne Chromosomen – nach Normalisierung der Anzahl der Integrationen auf die Länge jedes Chromosoms – eine statistisch signifikante Anreicherung der Integrationsstellen in der zentromeren Region von Chromosom 20 in Tumorproben (P = 0,018, NPC). Test) (Ergänzungsdaten 2), wohingegen Nicht-Tumorproben eine relativ zufällige Verteilung der Integrationsstellen über die Chromosomen aufwiesen. Um zu beurteilen, ob die Position der HBV-Integrationen im Wirtsgenom mit der klonalen Expansion zusammenhängt, führten wir einen Vergleich zwischen der genomischen Position der klonal expandierten und einzelnen HBV-Integrationen in Tumor- und Nicht-Tumorgeweben durch. Wir fanden heraus, dass sowohl klonale als auch einzelne Integrationen eine vergleichbare Verteilung in Genen und intergenen Regionen der Tumor- und Nicht-Tumor-Gewebeproben zeigten.

Da klonale Integrationen mit Genen in Verbindung gebracht wurden, die an der malignen Transformation beteiligt sind, haben wir unseren Datensatz auf die Anreicherung von Integrationen in HCC-assoziierten Genen untersucht. Die klonal erweiterten Gene, auf die in unserer Studie die HBV-Integration abzielt, wurden mit denen verglichen, die kürzlich in der Viral Integration Site Database (VISDB, verfügbar unter https://bioinfo.uth.edu/VISDB), der umfassendsten Sammlung viraler Integrationsstellen, veröffentlicht wurden ( VISs) für DNA-Viren (einschließlich HBV) und RNA-Retroviren26. Von den 5573 in VISDB gemeldeten HBV-Zielgenen bei HCC wurden 381 in Gewebeproben der 7 untersuchten Patienten nachgewiesen (323 in Tumor- und 58 in Nicht-Tumor-Gewebeproben). Unter den 381 auf HBV gerichteten Genen sind 35 (AOAH, ANKS1B, CAMTA1, CDH4, CYP2E1, DSCAML1, EXOC4, FCHSD2, FSTL4, HIVEP3, HSPA12A, IGH, IQSEC1, JARID2, KCNQ3, LMF1, MED26, MLPH, MPG, NFAT5, NCOR2, PLD5, PTPRG, PTPRM, TRAPPC9, SLC29A3, SDCCAG8, SMOC1, SYNGR1, TGFBRAP1, WDR66, WNK2, ZHX2, ZMIZ1, ZNF536) waren wiederholt betroffen (in 2 oder mehr Proben) in Tumorgeweben und 1 (NRG3) in nicht -Tumorgewebe. In einzelnen Proben auftretende Integrationsereignisse wurden in den folgenden krebsauslösenden Genen beobachtet: TERT, KMT2B (MLL4), RIMS1, FN1, RBFOX1, CNTNAP2 und THRB7,11,12,14,27,28. Darüber hinaus fanden wir in Tumorgewebeproben sieben weitere Gene, die wiederholt von der HBV-Integration betroffen sind: ECE1, EVI5L, KIF13B, MTX1P1, PLXND1, TECR und USP24.

Die HBV-Integrationsstellen wurden ebenfalls mit Anmerkungen versehen, um ihre Verteilung in verschiedenen genomischen Elementen zu analysieren. Integrationen waren in einfachen Wiederholungen in Nichttumorproben häufiger als in Tumorproben [60/290 (20,7 %) gegenüber 88/1817 (4,8 %); P < 0,001, Z-Test], wohingegen eine statistisch signifikante Anreicherung der Integrationen für repetitive Sequenzen in Tumorproben im Vergleich zu Nicht-Tumorproben beobachtet wurde [1376/1817 (75,7 %) gegenüber 179/290 (61,7 %); P < 0,001, Ζ-Test]. Tumorgewebe zeigten auch eine signifikant höhere Anzahl von Integrationen in kurze eingestreute Kernelemente (SINEs, 310/1817 (17 %) gegenüber 26/290 (8,9 %; P < 0,001) und Retrotransposons mit langen terminalen Wiederholungen (LTR) [264/1817 (14,5 %) gegenüber 28/290 (9,6 %; P = 0,024). Eine große Anzahl von HBV-Integrationen trat auch in lang eingestreuten Kernelementen (LINEs) auf [250/1817 (13,7 %) gegenüber 40/290 (13,7 %) ; P = 0,999], obwohl keine signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Nicht-Tumor-Gewebeproben beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 1). Interessanterweise wurde eine Anreicherung von HBV-Integranten, einschließlich der X-Genomregion, in den LINE-Sequenzen von Tumorgeweben gefunden [ 195/1817 (10,7 %) gegenüber 19/290 (6,5 %; P = 0,027), wohingegen virale Integranten, einschließlich S-Genomsequenzen, in LINEs signifikant häufiger auftraten (52/1817 (2,9 %) gegenüber 22/290 (7,6). %); P < 0,001) von Nicht-Tumor-Gewebeproben.

Die Charakterisierung von Bruchpunkten im HBV-Genom (ergänzende Abbildung 2) ergab eine Anhäufung von Integrationsbruchpunkten bei den Nukleotiden 1500–2000 – einschließlich des 3'-Endes des HBx und des 5'-Endes der Precore/Core-Gene – in Tumorgewebeproben [ 855/1817 (47,1 %) versus 75/290 (39,5 %), P < 0,0001] im Vergleich zu Nicht-Tumorgeweben. In Tumorgeweben wurde auch ein höherer Anteil an Integrationsstellen bei den Nukleotiden 1000–1200 gefunden, einschließlich des ENH I/X-Promotors [340/1817 (18,7 %) gegenüber 20/290 (6,9 %), P < 0,0001]. In Nicht-Tumor-Gewebeproben waren die HBV-Breakpoints bei den Nukleotiden 400–750 des S-Gens signifikant angereichert [460/1817 (25,3 %) gegenüber 147/290 (50,7 %), P < 0,0001]. Darüber hinaus war die immundominante „a-determinante“ Sequenz des S-Gens in einem signifikant höheren Anteil chimärer Sequenzen aus Nicht-Tumorproben enthalten [73/290 (25 %) gegenüber 75/1817 (4 %); P < 0,0001].

Um den Mechanismus der HBV-Integration aufzuklären, wurde das Vorhandensein von Mikrohomologie (MH)-Sequenzen zwischen Kern-DNA und HBV-DNA-Integranten auf der Ebene der Integrationsstellen untersucht. Wir fanden heraus, dass die meisten der 3339 HBV-Integrationsstellen in unseren Fällen das Vorhandensein von MH-Sequenzen sowohl in Tumor- als auch in Nicht-Tumorproben aufwiesen (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsdaten 1). Das Vorhandensein einer MH-Sequenzanreicherung an der Verbindungsstelle zwischen integriertem HBV und zellulärer DNA weist darauf hin, dass der MH-vermittelte Endverbindungs-DNA-Reparaturmechanismus (MMEJ) die Virusinsertion auf der Ebene genomischer Brüche fördern kann.

Unsere Analyse der HBV-Breakpoint-Verteilung führte dazu, dass wir mitochondriale DNA (mtDNA) als HBV-Integrationsziel identifizierten. Tatsächlich wurde im Vergleich zur Anzahl der Integrationen in einzelne Chromosomen eine statistisch hochsignifikante Anreicherung der Virusintegrationsstellen in mtDNA (P < 0,0001, NPC-Test) sowohl in Tumor- (P < 0,0001) als auch in Nicht-Tumorproben (P < 0,0001) beobachtet 0,0001), nach Normalisierung der Anzahl der Integrationen auf die Länge der mtDNA (unter Berücksichtigung einer mittleren Menge von 2000 Kopien der mtDNA pro Hepatozyten29) (Ergänzende Daten 2). Wir fanden 20 HBV-Integrationen in mtDNA (mit einer Länge zwischen 49 bp und 187 bp) aus Gewebeproben, die von 4 (0501, 0504, 0505 und 0506) der sieben untersuchten Patienten entnommen wurden (Abb. 3, Tabelle 3 und ergänzende Daten 3). . Insbesondere beobachteten wir eine Korrelation zwischen der HBV-Integration in mtDNA und höheren Serum-HBV-DNA-Spiegeln (rS = 0,899, P = 0,006; Spearman-Korrelationstest) sowie höheren intrahepatischen Mengen an HBV-DNA (rS = 0,866, P = 0,012) und pgRNA (rS = 0,878, P = 0,021) bei diesen Patienten. Von den 20 HBV-Integrationsstellen wurden 17 in mtDNA aus Tumorgeweben und 3 in mtDNA aus Nicht-Tumorgewebeproben nachgewiesen (Tabelle 3 und ergänzende Daten 3). Alle in Mitochondrien aus Tumor- und Nichttumorgeweben nachgewiesenen Integrationsbruchpunkte waren klonal erweiterte Integrationen. HBV-Integrationsstellen in mtDNA aus Tumorgeweben befanden sich im Vergleich zu denen aus Nicht-Tumorgeweben (11/17 gegenüber 0/3; P = 0,073, exakter Fisher-Test) bevorzugt innerhalb mitochondrialer Gene, die mit dem OXPHOS-System in Zusammenhang stehen letzter biochemischer Weg für die ATP-Produktion und besteht aus fünf Multiprotein-Enzymkomplexen (I–V) und zwei Elektronenträgern (Coenzym Q und Cytochrom c)30. Insbesondere wurden HBV-Integrationen in Tumorgewebeproben in mitochondrialen Genen nachgewiesen, die für die Kernuntereinheiten ND1, ND2, ND4 und ND5 von OXPHOS Complex I, CYTB von OXPHOS Complex III, COX1 von OXPHOS Complex IV und ATP6 von OXPHOS Complex V kodieren. Das mitochondriale Gen RNR2 (16 S rRNA) und die nichtkodierende mitochondriale Region der regulatorischen Verdrängungsschleife (D-Loop)30 waren ebenfalls Ziele von HBV in Tumorgeweben. Im Gegensatz dazu wurden HBV-Integrationen in mtDNA aus Nicht-Tumor-Gewebeproben nur innerhalb der D-Loop-Region gefunden (3/17 gegenüber 3/3; P = 0,017). Patient 0504 zeigte die höchste Anzahl viraler Integrationen in mtDNA mit 12 verschiedenen Integrationsstellen in der Tumorprobe (3 in RNR2, 2 in ND4, 2 in ND5, 1 in ND1, 1 in ATP6, 1 in CYTB und 2 in D-Loop-Region) und 1 in der Nicht-Tumor-Gewebeprobe (in der D-Loop-Region) (Abb. 3, Tabelle 3 und ergänzende Daten 3). Die HBV-Integration in der D-Loop-Region (ergänzende Abbildung 3a, b) sowie in den Genen RNR2, CYTB (ergänzende Abbildung 4a, b) und ND5 (ergänzende Abbildung 5) wurde bei diesem Patienten bestätigt Sanger-Sequenzierung. Was das ND5-Gen betrifft, führten Klonen und Sanger-Sequenzierung dazu, dass wir die gesamte in dieses Gen integrierte HBV-Sequenz identifizieren konnten (ergänzende Abbildung 5). Die Länge des integrierten viralen Fragments betrug 363 bp und umfasste zwei Elemente der Gamma-Interferon-Aktivierungsstelle (GAS) und die HBV-ENHI-Region.

HBV-Gene werden in Schwarz (Polymerase, Pol), Grün (Precore/Core, C), verschiedenen Blauverläufen (preS/S) und Orange (X) dargestellt. Mitochondriale Gene werden in Blaugrün, Hellgrün und Rot dargestellt. Die mitochondriale D-Loop-Regulationsregion ist grau dargestellt. HBV-Mitochondrien-Übergänge in Tumorgeweben werden durch rote Linien dargestellt. HBV-Mitochondrien-Übergänge in nicht tumorösen Geweben werden durch blaue Linien dargestellt.

Die Analyse der HBV-Genom-Bruchpunkte zeigte eine nicht-tumorale Anreicherung der Integrationsstellen bei den Nukleotiden 2877–752 (einschließlich der preS/S-Region) innerhalb der D-Loop-Region und einen höheren Anteil an Bruchpunkten bei den Nukleotiden 1000–1887 (einschließlich der ENH I/ X-Promotor, das X-Gen, das ENH II/BCP und die Precore-Region) innerhalb proteinkodierender mitochondrialer Gene (Abb. 3) in Tumorgeweben. Das Vorhandensein einer Mikrohomologie (MH) im Bereich von 1 bp bis 18 bp zwischen integriertem HBV und mtDNA an der Stelle der Virus-Mitochondrien-Verbindung wurde für 19 der 20 Integrationsverbindungen beobachtet (Supplementary Data 3), was darauf hindeutet, dass MMEJ ebenfalls eine Rolle spielen könnte eine wichtige Rolle im Prozess der HBV-Integration in mtDNA.

Um die Auswirkung einer solchen viralen Integration auf die mitochondriale Genexpression zu überprüfen, führten wir eine RNASeq-Analyse durch, obwohl hochwertige RNA (RNA-Integritätszahl ≥8) zur Durchführung dieser Analyse nur von Patient 0504 erhalten wurde. Zu den im Tumorgewebe nachgewiesenen chimären Transkripten gehört Wir identifizierten Fusionssequenzen, die einen Teil der mitochondrialen Gene RNR2 und ND4 enthielten und entsprechende Integrationsstellen in mtDNA aufwiesen (Supplementary Data 3).

Es ist bekannt, dass mtDNA in den Zellkern eindringen und sich an DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) in das Kerngenom integrieren kann, wodurch Kernkopien von mtDNA-Sequenzen (Numts) entstehen31. Daher können wir nicht ausschließen, dass die von HBIS in den Mitochondrien der Patienten nachgewiesenen HBV-Integranten stattdessen innerhalb von Numts lokalisiert sein könnten. Um dies zu klären, führten wir eine eingehendere Untersuchung der HBV-Integration in der HepAD38-Zelllinie durch, die die durch Tetracyclin (Tet) induzierbare HBV-Replikation unterstützt32. Nach der Tet-Entfernung aus dem Kulturmedium produzieren diese Zellen virale RNAs, sammeln subvirale Partikel im Zytoplasma an, die für die Virusreplikation charakteristische DNA-Zwischenprodukte enthalten, und sezernieren virusähnliche Partikel32, die entweder HBV-DNA oder RNA enthalten, in den Überstand33. Wir untersuchten die HBV-Integration in HepAD38-Zellen – sowohl durch HBIS als auch durch RNASeq – nach 7-tägiger Tet-Entfernung. Zu diesem Zeitpunkt betrugen die mittleren Mengen an HBV-DNA und HBV-RNA in HepAD38-Zellen 1,1 × 103 ± 6,0 × 102 bzw. 1,0 × 10 ± 5,9 × 10–1 Kopien/Zelle; während die mittleren Mengen an HBV-DNA und HBsAg in den Zellüberständen 2 × 106 ± 2,7 × 104 Kopien/ml bzw. 4,1 × 103 ± 7,2 × 102 IU/ml betrugen. Daher verwendeten wir zu diesem Zeitpunkt HBIS, um das Vorhandensein von HBV-Integrationsstellen sowohl in DNA, die aus gereinigten Kernen extrahiert wurde, als auch in DNA, die aus gereinigten Mitochondrien von HBV-produzierenden HepaD38-Zellen erhalten wurde, zu untersuchen, während wir RNASeq verwendeten, um das Vorhandensein von Hybridtranskripten zu analysieren in gereinigten Kernen plus Zytoplasma und in isolierten Mitochondrien aus denselben Zellen. Basierend auf HBIS wurde keine virale Integration in potenziellen Zahlen festgestellt, die in der Kern-DNA von HBV-produzierenden HepAD38-Zellen vorhanden waren, wohingegen wir HBV-Integrationsstellen in den COX1-, RNR2- und ND2-Genen in DNA aus gereinigten Mitochondrien nachweisen konnten (Supplementary Data 4). Analog zeigte RNASeq keine virale Integration in nuklearen/zytoplasmatischen RNA-Extrakten aus HBV-produzierenden HepAD38-Zellen, aber mehrere chimäre HBV-Mitochondrien-Sequenzen, die einen Teil der COX1-, COX3-, ND4- und ND6-Sequenzen enthielten, wurden in der aus Mitochondrien von HBV isolierten RNA identifiziert. Produktion von HepAD38-Zellen (Supplementary Data 4 und Supplementary Abb. 6).

Lebergewebeproben für zusätzliche Analysen standen nur von drei (0501, 0504 und 0505) der vier Patienten mit HBV-Integration in mtDNA zur Verfügung. Um die HBV-Integration in mtDNA weiter zu untersuchen, wurde das Vorhandensein des freien HBV-Genoms und der HBV-Transkripte in Mitochondrien und Zellkernen aus Tumorgewebeproben der Patienten 0501, 0504 und 0505 sowie aus Lebergewebeproben von fünf Patienten mit chronischer HBeAg-negativer Erkrankung analysiert Hepatitis B (CHB) mit aktiver Virusreplikation (mittlerer Serum-HBV-DNA-Spiegel: 5,6 × 107 ± 3,06 × 107 IU/ml) (Abb. 4a, c). Als Negativkontrollen dienten Mitochondrien und Kerne aus Lebergewebeproben von acht HBV-negativen Patienten und aus HepG2-Zellen (Abb. 4b, d). Weder das vollständige HBV-Genom noch die HBV-cccDNA wurden in Mitochondrien aus den analysierten Lebergewebeproben oder HepG2-Zellen nachgewiesen (Abb. 4a, b). Die Analyse von HBV-Transkripten ergab jedoch das Vorhandensein von HBV-RNA-Sequenzen, die den Genomregionen PreS1, S, Epsilon und Abb. 4e). Es ist bekannt, dass Mitochondrien eine Vielzahl von kernkodierten RNAs importieren34,35,36,37,38. Der Import der meisten dieser RNAs in Säugetierzellen wird durch PNPASE reguliert, das auch 3' → 5'-Exoribonuklease- und Poly-A-Polymerase-Aktivitäten besitzt und im mitochondrialen Intermembranraum (IMS) lokalisiert ist35,36,39. In Anbetracht der Tatsache, dass PNPASE verschiedene RNAs, die ein bestimmtes Importsignal, nämlich eine kleine Stamm-Schleifen-Struktur, enthalten, in Mitochondrien transloziert, versuchten wir herauszufinden, ob eine ähnliche Importsequenz (und Struktur) in HBV-Transkripten vorhanden ist. Bemerkenswerterweise wurde in der preS1-Region (nt 3049–3065) eine nahezu identische Importsignalsequenz identifiziert (Abb. 5a). Darüber hinaus haben wir uns gefragt, ob die Stamm-Schleifen-Strukturen von HBV-Transkripten am 5'-Ende und in der Nähe des 3'-Endes, wie „Epsilon“ und PRE [posttranskriptionelles regulatorisches Element, das die Stammschleife α (SLα, Nukleotide 1292) umfasst –1321) und SLβ (Nukleotide 1411–1433)]40 fungieren als mitochondriale Importsequenzen. Nachdem wir festgestellt hatten, dass PNPASE von HepG2-Zellen produziert wurde (Abb. 5b), überprüften wir, ob sich HBV-RNAs auch in Mitochondrien lokalisieren, indem wir einen In-vitro-Importassay unter Verwendung einer synthetisierten Biotin-markierten Sequenz des PreS1-Transkripts (nt 2850–837, einschließlich) durchführten mutmaßliches PreS1-Importsignal), des Polymerase-Transkripts (nt 670–1350, einschließlich SLα), der pgRNA (nt 1781–2068, einschließlich Epsilon) und des X-Transkripts (nt 1376–1840, einschließlich SLβ). RNA-Sequenzen und Mitoplasten wurden aus HepG2-Zellen isoliert. Vor der RNA-Isolierung und der RT-PCR wurde eine Nukleasebehandlung durchgeführt, um nicht importierte RNA zu entfernen. Alle Biotin-markierten HBV-RNA-Sequenzen wurden in Mitochondrien importiert, nicht jedoch die COX3-mRNA, die als Kontrolle verwendet wurde (Abb. 5c, d). Diese Ergebnisse veranlassten uns zu überprüfen, ob PNPASE beim Import von HBV-RNAs helfen könnte. Daher untersuchten wir, ob HBV-RNAs direkt an PNPASE binden. Aus HepG2-Zellen isolierte Mitochondrien wurden – nach Behandlung mit Digitonin und Nuklease – mit in vitro synthetisierten, Biotin-markierten HBV-RNAs inkubiert. Die biotinylierten viralen RNA-Sequenzen wurden mit Streptavidin-beschichteten Perlen heruntergezogen und die RNA-bindende PNPASE wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen (Abb. 6). Wichtig ist, dass PNPASE, aber nicht HSP90 (als Kontrolle verwendet), an die in vitro transkribierten RNA-Sequenzen band, die das mutmaßliche PreS1-Importsignal (nt 2850–837), SLα (nt 670–1350) und Epsilon (nt 1781–2068) enthielten. und SLβ (nt 1376–1840) (Abb. 6a, b). Darüber hinaus banden HBV-RNA-Sequenzen spezifisch an PNPASE, die COX3-RNA-Sequenz jedoch nicht (Abb. 6a, b). Diese Ergebnisse deuten auf die strukturelle Spezifität des mitochondrialen viralen RNA-Imports und die direkte Beteiligung von PNPASE an diesem Prozess hin.

Das vollständige HBV-Genom, die HBV-cccDNA und die HBV-RNA in Mitochondrien wurden in mit Nuklease behandelten Mitoplasten und in Kernen analysiert, die aus Tumorgewebeproben der Patienten 0501, 0504 und 0505 sowie aus Lebergewebeproben von 5 Patienten mit chronischer Hepatitis B (CHB) isoliert wurden ) mit aktiver Virusreplikation. Als Negativkontrollen wurden mit Nuklease behandelte Mitoplasten und Kerne verwendet, die aus Lebergewebeproben von acht HBV-negativen Patienten (Pt.1–Pt.8) isoliert wurden. Zur Vermeidung einer zytosolischen Kontamination wurden Mitoplasten verwendet, deren mitochondriale Außenmembran durch Digitonin-Behandlung entfernt wurde. a Fehlen des vollständigen HBV-Genoms und der HBV-cccDNA in Mitochondrien, die aus Lebergewebeproben von HBV-positiven Patienten isoliert wurden. b Fehlen des vollständigen HBV-Genoms und der HBV-cccDNA in Mitochondrien, die aus Lebergewebeproben von HBV-negativen Patienten isoliert wurden. c Nachweis des vollständigen HBV-Genoms und der HBV-cccDNA in Kernen, die aus Lebergewebeproben von HBV-positiven Patienten isoliert wurden. d Fehlen des vollständigen HBV-Genoms und der HBV-cccDNA in Kernen, die aus Lebergewebeproben von HBV-negativen Patienten isoliert wurden. Gesamt-DNA-Extrakte aus HepG2-Zellen und dem rekombinanten Plasmid pFC80 (enthaltend 4 Kopf-an-Schwanz-HBV-Genome mit 1,0-facher Länge) wurden als negative bzw. positive Kontrolle von PCR-Experimenten verwendet. e Nachweis von HBV-RNA-Sequenzen, die den Epsilon-Genomregionen PreS1, S, GAPDH wurde als zytosolischer Marker und COX3 als mitochondrialer Marker verwendet. COX3-mRNA, jedoch nicht GAPDH-mRNA, wurde in Mitochondrien aus denselben HBV-positiven und HBV-negativen Lebergewebeproben oder HepG2-Zellen nachgewiesen.

a Ausrichtung von Nukleotidsequenzen und Sekundärstrukturen mitochondrialer RNA-Targeting-Signale in RNase P- und HBV-PreS1-RNAs (GenBank-Referenzsequenz: NC_003977; HBV-Genomnukleotide: 3049–3065). b PNPASE-Immunoblot von HepG2- und HepAD38-Zellen. Als Beladungskontrolle wurde β-Tubulin verwendet. c In-vitro-Import von HBV-RNA-Fragmenten, die PreS1 (einschließlich des mutmaßlichen PreS1-Targeting-Signals), Polymerase (Pol) (einschließlich Stem-Loop α, SLα), pgRNA (einschließlich Epsilon) und X (einschließlich Stem-Loop β, SLβ) entsprechen. Transkripte sowie eines COX3-mRNA-Fragments in Mitochondrien von HepG2-Zellen. In vitro transkribierte PreS1-, Pol-SLα-, Epsilon- und X-SLβ- oder COX3-RNA (Eingabe) wurden mit Mitochondrien aus HepG2-Zellen inkubiert. Nicht importierte RNA wurde mit Nuklease verdaut. d Quantifizierung des relativen Importniveaus durch Densitometriemessungen.

Aus HepG2-Zellen isolierte Mitochondrien wurden – nach Behandlung mit Digitonin und Nuklease – mit in vitro synthetisierten, Biotin-markierten HBV-RNAs inkubiert. Die biotinylierten viralen RNA-Sequenzen wurden mit Streptavidin-beschichteten Perlen heruntergezogen und die RNA-bindende PNPASE wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. eine PNPASE, aber nicht HSP90 (als Kontrolle verwendet), gebunden an die in vitro transkribierten RNA-Sequenzen, die das mutmaßliche PreS1-Targeting-Signal (Nukleotide (nt) 2850–837), Stem-Loop α (nt 670–1350), Epsilon ( nt 1781–2068) und Stem-loop β/X (nt 1376–1840). Darüber hinaus banden HBV-RNA-Sequenzen spezifisch an PNPASE, die COX3-mRNA-Sequenz jedoch nicht. β-Tubulin wurde als zytosolischer Marker und Mortalin als mitochondrialer Marker verwendet. b Quantifizierung der relativen HBV-RNA-bindenden PNPASE-Spiegel durch Densitometriemessungen.

In dieser Studie haben wir eine Hochdurchsatz-HBV-Integrationssequenzierungsmethode (HBIS) entwickelt, die eine empfindliche Identifizierung von HBV-Integrationsstellen und die Zählung von Integrationsklonen ermöglicht. Der HBIS-Ansatz wurde von einer Integrationssequenzierungsmethode übernommen, die ursprünglich zur Untersuchung des Integrationsprofils von HIV-1 während einer latenten und aktiven Infektion entwickelt wurde21. Dieser Ansatz führte uns dazu, eine sehr große Anzahl von HBV-Integrationsstellen in Tumor- und angrenzenden Nicht-Tumor-Lebergeweben von Patienten mit HBV-bedingtem HCC zu identifizieren und zu charakterisieren. Alle Tumor- und Nicht-Tumorgewebe zeigten eine HBV-Integration, mit durchschnittlich 257 Integrationen pro Patient. In Übereinstimmung mit früheren Studien7,11,27,41 stellten wir fest, dass die Gesamtzahl der HBV-Integrationsstellen und die Zahl der klonal erweiterten Integrationen in Tumor-Lebergeweben höher sind als in Nicht-Tumor-Lebergeweben. Allerdings zeigten Tumore einen deutlich höheren Anteil an kleinen Klonen und einzelnen Integrationsstellen als Nicht-Tumorgewebe. Diese Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, dass die analysierten HCCs histologisch als gut bis mäßig differenziert eingestuft wurden, die HBV-Replikation und -Transkription unterstützten und den NTCP-Viruseintrittsrezeptor exprimierten. Eigenschaften, die diese HCCs möglicherweise anfälliger für die Anhäufung von Integrationen mit einer höheren Häufigkeit als angrenzende Nicht-HCCs gemacht haben könnten -Tumorgewebe. Die Persistenz der HBV-Replikation und das Auftreten neuer Integrationsereignisse in Tumorgeweben könnte auch die große Anzahl von HCC-assoziierten Genen erklären, auf die die HBV-Integration abzielt und die in jedem einzelnen Tumor gefunden wurden. Viele dieser Integrationen könnten in bereits fehlregulierten Krebsgenen stattgefunden haben; Daher stellen sie möglicherweise lediglich ein Epiphänomen dar und fungieren als Passagierereignisse. Dennoch könnten einige dieser Integrationen immer noch eine Rolle bei der HCC-Progression spielen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Tumordifferenzierung und ihr permissiver Zustand für die HBV-Replikation bei der Bewertung der HBV-Integration in HCC berücksichtigt werden sollten. Tatsächlich können solche Aspekte die Anzahl und Art der HBV-Integrationsereignisse zwischen verschiedenen HCCs stark beeinflussen und zu verzerrten Ergebnissen führen, wenn große Serien von Tumoren mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad bewertet und mit gepaarten Nicht-Tumor-Lebergeweben verglichen werden. Darüber hinaus beobachteten wir in Übereinstimmung mit früheren Berichten eine erhebliche Anreicherung der HBV-Integrationen in repetitive Sequenzen9,14,16. Wir haben auch bestätigt, dass Integrationsereignisse häufiger in einfachen Wiederholungen in Nicht-Tumorgeweben auftreten16 und dass sich virale Integrationsstellen in Tumorgeweben oft innerhalb transponierbarer Elemente17,18,42 befinden, die bekanntermaßen bei zahlreichen menschlichen Krebsarten überexprimiert und mobilisiert werden43, 44.

Interessanterweise identifizierten wir durch die Anwendung des HBIS-Ansatzes und einer spezifischen bioinformatischen Pipeline mtDNA als einen Ort der HBV-Integration. Tatsächlich wurde bei vier der sieben untersuchten Patienten eine signifikante Anreicherung der klonal erweiterten Virusintegration in mtDNA sowohl aus Tumor- als auch Nicht-Tumor-Lebergewebeproben festgestellt. Wenn man bedenkt, dass (a) die virale Integration in mtDNA eine de novo somatisch erworbene Mutation ist, (b) mtDNA in Tausenden von Kopien pro Hepatozyten vorhanden ist und (c) sowohl Wildtyp- als auch mutierte mtDNA-Moleküle in einer einzelnen Zelle koexistieren können ( mtDNA-Heteroplasmie)29 stellten wir die Hypothese auf, dass die HBV-Integration bei diesen vier Patienten über viele Zellteilungen hinweg mit einer ziemlich konstanten und hohen Rate pro mitochondrialer Genomreplikation hätte erfolgen müssen. Bemerkenswerterweise befanden sich HBV-Integrationsstellen in mtDNA aus Tumorgewebeproben sowohl in der D-Loop-Region (der Hauptkontrollstelle für die mtDNA-Expression, die den Replikationsursprung des Leitstrangs und die Hauptpromotoren für die Transkription enthält45) als auch in mitochondrialen Genen, die dafür kodieren Proteine ​​des OXPHOS-Systems, das die mitochondriale Funktion aufrechterhält und eine zentrale Rolle im zellulären Energiestoffwechsel spielt30, wohingegen Integrationen in Nicht-Tumorgewebe nur in der regulatorischen D-Loop-Region nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse führten uns zu der Annahme, dass die Integration von HBV in mitochondriale OXPHOS-Gene das Überleben nicht transformierter Hepatozyten beeinträchtigen könnte. Obwohl eine kritische Anzahl mutierter mtDNAs vorhanden sein muss, bevor Zellen kritisch geschädigt werden und Gewebedysfunktionen sowie klinische Symptome sichtbar werden (der sogenannte Schwellenwerteffekt), gelten Gewebe mit einem hohen Bedarf an oxidativem Stoffwechsel, wie z. B. Muskeln , das Gehirn und die Leber haben relativ niedrige Schwellenwerte und sind besonders anfällig für mtDNA-Mutationen46. Umgekehrt scheinen Leberkrebszellen in der Lage zu sein, die HBV-Integration in Gene des OXPHOS-Systems zu tolerieren. Diese Ergebnisse stimmen mit Literaturdaten überein, die zeigen, dass Aberrationen, an denen OXPHOS-Gene beteiligt sind, bei mehreren Krebsarten deutlich verstärkt auftreten47. Tatsächlich wurde eine große Anhäufung mutierter Mitochondrien bei Nieren-, Darm- und Schilddrüsenkrebs festgestellt47, was auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Inaktivierung der Mitochondrien und tumorerzeugenden Wirkungen hinweist. Mutationen in OXPHOS-Genen sind mit einer Hochregulierung der Glykolyse und Laktatproduktion sowie mit einer Überproduktion von ROS und Onkometaboliten verbunden48, was onkogene und metabolische Signalwege stimuliert und Auswirkungen auf die Tumormikroumgebung hat48. Diese veränderte Mikroumgebung kann wiederum eine mitochondriale metabolische Neuprogrammierung von Krebszellen induzieren49. Die durch mtDNA-Mutationen verliehene metabolische Plastizität neoplastischer Zellen ist erforderlich, um den zellulären Biomasse- und Energiebedarf zu decken, der für ihre Proliferation und für ihre Anpassung an neue Mikroumgebungen von Primärtumoren und metastatischen Nischen erforderlich ist . Daher könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass durch die HBV-Integration induzierte Veränderungen in den OXPHOS-Genen bestehen bleiben und/oder ausgewählt werden könnten, um die Stoffwechseleffizienz von präneoplastischen Hepatozyten oder Krebsleberzellen während der Tumorentwicklung zu beeinflussen.

Was die mitochondriale D-Loop-Region betrifft, zeigen unsere Ergebnisse, dass diese Region von der HBV-Integration sowohl in Tumor- als auch Nicht-Tumor-Lebergewebe betroffen sein kann, was darauf hindeutet, dass die Virusintegration in der D-Loop-Region ein Ereignis ist, das der hepatozellulären Transformation vorausgehen kann und könnte während der Hepatokarzinogenese eine positive Selektion durchlaufen. Die HBV-Integration in der D-Loop-Region kann die Replikation und Transkription von mtDNA beeinträchtigen und zu mitochondrialer Instabilität und Fehlfunktion führen51. Insgesamt stimmen unsere Ergebnisse mit Daten aus früheren Studien überein, die eine hohe Häufigkeit von D-Loop-Mutationen sowohl in HCC- als auch in angrenzenden Nicht-HCC-Geweben berichten52,53,54. Daher unterstützen unsere Daten zusammen mit Erkenntnissen aus früheren Studien 52, 53, 54 den entscheidenden Beitrag von Mutationen der mtDNA-D-Loop-Region zur Hepatokarzinogenese. Die Ergebnisse unserer Studie verdeutlichen auch ein deutliches Verteilungsmuster der HBV-Integrationsstellen in mtDNA in Tumor- und Nicht-Tumor-Lebergeweben. Allerdings ist zu beachten, dass in dieser Studie nur eine kleine Anzahl von Fällen ausgewertet wurde und die Ergebnisse in größeren Patientenkohorten bestätigt werden müssen.

Basierend auf der RNASeq-Analyse haben wir herausgefunden, dass die Stelle der HBV-Insertion in mtDNA möglicherweise transkriptionell aktiv ist. Tatsächlich wurden HBV-Mitochondrien-Fusionstranskripte, die einen Teil mitochondrialer Sequenzen von OXPHOS-Genen enthielten, sowohl bei Patienten als auch in HBV-induzierten HepAD38-Zellen nachgewiesen. Wir nutzten diese Zellen für eine eingehende Untersuchung der HBV-Integration in mtDNA und um zu bewerten, ob die HBV-Integration in Numts statt in mtDNA erfolgen kann. Es ist gut dokumentiert, dass Fragmente mitochondrialer DNA in das Kerngenom translozieren können, um Numts zu erzeugen31. Allerdings wurden seit ihrer Beschreibung im Jahr 1983 nur etwas mehr als 1000 Numts beim Menschen identifiziert, was in den getesteten Proben sehr geringe Häufigkeiten aufwies. Die Größe der Zahlen reicht von ~50 bp bis >15 kb, wobei mehr als 20 % eine Länge von weniger als 100 bp haben31,46,55. Wenn man bedenkt, dass mtDNA durchschnittlich mehrere tausend Kopien pro Hepatozyten aufweist, verglichen mit zwei Kopien von Numts in Kern-DNA (nDNA), ist es durch die Isolierung von Mitochondrien aus Zellen möglich, Numts vollständig zu verdünnen, was zu Numts-freien mtDNA-Sequenzen führt. Um die mtDNA-HBV-Integration zu untersuchen, isolierten wir daher Kerne, Zytoplasma und Mitochondrien aus HBV-produzierenden HepAD38-Zellen und verwendeten sowohl HBIS als auch RNASeq. Laut HBIS wurden mehrere HBV-Integrationsstellen in aus Mitochondrien isolierter DNA identifiziert, wohingegen in vielen Fällen aus nDNA keine Integration nachgewiesen wurde. Darüber hinaus zeigte RNASeq das Vorhandensein chimärer HBV-Mitochondrien-Transkripte in Mitochondrien, jedoch nicht im Zytoplasma oder in den Kernen von HBV-produzierenden HepAD38-Zellen, und mtDNA-Insertionsstellen könnten in diesen Zellen transkriptionell aktiv sein. Sowohl die HBIS- als auch die RNAseq-Analyse ergaben außerdem, dass MMEJ eine wichtige Rolle bei der HBV-Integration in mitochondrialen Genomen spielt. Zusammenfassend zeigen unsere Daten daher deutlich, dass HBV in die mtDNA von Tumor- und Nicht-Tumor-Hepatozyten integrieren kann. Einige frühere Studien haben Daten zur HBV-Integration in mtDNA berichtet16,56,57,58,59,60. Alle diese Studien verwendeten Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze zur HBV-Genomanreicherung, um die HBV-Integration zu untersuchen, und die meisten von ihnen analysierten Hepatomzelllinien, die HBV-DNA stabil exprimieren56,57,58,59. Nach unserem besten Wissen ist nur eine16 davon Veröffentlichungen haben über Daten zur HBV-Integration in mtDNA aus menschlichem Lebergewebe berichtet. Insbesondere wurden im ergänzenden Datensatz dieser Arbeit 58 verschiedene HBV-Integrationsstellen in mtDNA aus Tumor- und/oder Nicht-Tumor-Lebergewebeproben von 11 Patienten mit HBV-bedingtem HCC aufgeführt16. Die mitochondrialen Genomregionen, auf die die HBV-Integration bei den 11 Patienten am häufigsten abzielte, waren die D-Loop-Region sowie die Gene ND4, ND5, RNR2, CYTB, ND6, ND1, ND2 und COX316. HBV-Integrationsereignisse wurden auch in mtDNA aus humanisierten Lebergewebeproben chimärer Mäuse beschrieben60. In dieser Studie haben Furuta et al.60 50 verschiedene HBV-Integrationsstellen in mtDNA von chimären Mäusen identifiziert. Diese Integrationen (a) wurden mit höheren Niveaus der HBV-Replikation in Verbindung gebracht, (b) traten häufiger in der D-Loop-Region auf und (c) schienen auf MMEJ60 zu beruhen. In Studien, die an PLC/PRF/5-Zelllinien durchgeführt wurden, wurden keine detaillierten Informationen zu Virus-mtDNA-Verbindungen bereitgestellt56,59. Die Tatsache, dass in diesen Zellen, die HBV nicht replizieren und nur mehrere unterschiedliche virale RNAs von HBV-Integranten exprimieren, eine HBV-Integration in mtDNA stattfinden kann, legt jedoch nahe, dass virale RNA am Prozess der HBV-Integration in mtDNA beteiligt sein könnte. Trotz einer Reihe von Studien, die die Interaktion zwischen HBV-Proteinen und Mitochondrien und die daraus resultierende Veränderung der Mitochondrienfunktionen 61,62,63 dokumentieren, wurde die Frage, ob HBV-Nukleinsäuren in Mitochondrien translozieren können, nur minimal untersucht. Basierend auf unseren Ergebnissen können sich HBV-Transkripte, jedoch nicht das virale Volllängengenom oder cccDNA, in Mitochondrien lokalisieren. Darüber hinaus vermittelt PNPASE, ein mitochondriales Protein, das als erster RNA-Importfaktor für Mitochondrien von Säugetieren gilt35,36,39, möglicherweise die Abgabe viraler RNA in die mitochondriale Matrix. Eine PNPASE-abhängige RNA-Importsequenz, die wir für das preS1-Transkript identifiziert haben, sowie bekannte Stamm-Loop-Strukturen, die spezifisch für HBV-Transkripte sind, scheinen das mitochondriale Targeting viraler RNAs zu vermitteln. Die Lokalisierung von HBV-Transkripten in Mitochondrien lässt uns vermuten, dass virale RNA ein mögliches Substrat für die HBV-Integration in mtDNA darstellen könnte. Das mitochondriale Genom ist anfälliger für Schäden und die Bildung von Doppelstrangbrüchen (DSB) als das Kerngenom, da es häufig den ROS ausgesetzt ist, die durch die oxidative Phosphorylierung der Mitochondrien entstehen, und weil es an schützenden Histonen mangelt. Wenn man bedenkt, dass mehrere Berichte gezeigt haben, dass RNA-Moleküle direkt als Vorlage für die Reparatur mitochondrialer DSBs in menschlichen Zellen dienen können64, ist es verlockend zu spekulieren, dass die virale Ausnutzung dieses Weges dazu führen könnte, dass HBV-Sequenzen in das mitochondriale Genom eingefügt werden. Zusammenfassend stellten wir fest, dass HBV in mtDNA integriert werden kann, wobei Tumore und Nicht-Tumor-Lebergewebe unterschiedliche Profile der viralen Integration in das mitochondriale Genom aufweisen. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass HBV-RNA möglicherweise aktiv in Mitochondrien importiert wird und dass virale RNA-Sequenzen am Prozess der HBV-Integration in mtDNA beteiligt sein könnten. Trotz der relativ begrenzten Patientenstichprobe bietet diese Studie neue Einblicke in die HBV-Hepatozyten-Interaktion und stellt eine neue Grundlage für Untersuchungsanalysen dar, die zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen können, durch die die HBV-Insertion die Entwicklung und das Fortschreiten von HCC vorantreiben kann.

Es wurden Tumorgewebe von sieben HBsAg-positiven Patienten (6 Männer, 1 Frau; Durchschnittsalter 66,7 ± 8 Jahre) mit HBV-bedingtem HCC und paarweise angrenzendes Nicht-Tumorgewebe von sechs von ihnen untersucht. Die klinischen, histologischen und virologischen Merkmale der Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Als Negativkontrolle wurden zwei normale Leberproben von HBV-negativen Patienten verwendet, die sich einer Operation wegen Lebermetastasen unterzogen hatten. Alle durch chirurgische Resektion an der Abteilung für Onkologiechirurgie des Universitätsklinikums von Messina, Italien, entnommenen Lebergewebeproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 ° C gelagert. Um das Vorhandensein von freiem HBV-Genom und HBV-Transkripten in Mitochondrien zu untersuchen, wurden außerdem gefrorene Leberbiopsien von fünf Patienten mit HBeAg-negativer chronischer Hepatitis B (CHB) (2 Frauen, 3 Männer; Durchschnittsalter: 59,4 ± 15,8 Jahre) entnommen. untersucht, die eine aktive Virusreplikation zeigten (mittlerer Serum-HBV-DNA-Spiegel: 5,6 × 107 ± 3,06 × 107). Darüber hinaus wurden acht gefrorene Leberbiopsien von HBsAg-negativen Patienten (4 Frauen und 4 Männer; Durchschnittsalter 53,75 ± 11,5 Jahre) mit chronischer Lebererkrankung (CLD) als Kontrollgruppe in diese Studie einbezogen. Zwei der acht Patienten hatten eine HCV-bedingte CLD; Von den sechs Anti-HCV-negativen Personen hatten fünf eine nichtalkoholische Steatohepatitis und einer eine kryptogene Lebererkrankung. Die acht Patienten waren negativ für eine okkulte HBV-Infektion. Alle oben genannten Leberbiopsien waren mit HBV-Genotyp D infiziert. Keiner der Patienten konsumierte Alkohol oder war mit dem Hepatitis-Delta-Virus oder HIV infiziert. Die Entnahme und Verarbeitung aller Proben wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Messina genehmigt (Protokoll Nr. 64/15) und in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Personen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Die Extraktion der gesamten DNA und RNA aus Leberbiopsieproben wurde wie zuvor beschrieben65 durchgeführt. Kurz gesagt, kryokonservierte Lebergewebeproben einzelner Patienten wurden mit einem TissueRuptor-Instrument (Qiagen, Mailand, Italien) in 500 μl Homogenisierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) bei 4 °C homogenisiert Dann wurde es in zwei gleiche Teile geteilt: Einer wurde für die DNA-Extraktion und der andere für die RNA-Extraktion verwendet. Die gesamte Leber-DNA wurde aus einem Teil des Homogenats in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 1 % SDS und Proteinase K (800 μg/ml) über Nacht bei 37 °C extrahiert. Nach der Extraktion mit Phenol-Chloroform wurden die Nukleinsäuren mit reinem kaltem Ethanol ausgefällt, resuspendiert und mit Pankreas-RNase (100 μg/ml) verdaut, gefolgt von der Extraktion mit Phenol-Chloroform und der Umfällung in reinem kaltem Ethanol. Die DNA wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 1 mM EDTA resuspendiert. Die gesamte Leber-RNA wurde aus der anderen Hälfte des Lebergewebehomogenats unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Waltham, MA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die RNA-Proben wurden 30 Minuten lang bei 37 ° C mit RQ1 RNase-Free DNase (Promega) behandelt und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert. Die RNA- und DNA-Konzentrationen wurden bei 260 nm mit einem ND-1000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies) gemessen.

Die Quantifizierung der gesamten intrahepatischen HBV-DNA und cccDNA wurde unter Verwendung der in Lit. beschriebenen Methode durchgeführt. 66, mit geringfügigen Änderungen. Kurz gesagt, qRT-PCR-Experimente zur Bewertung der Mengen der gesamten intrahepatischen HBV-DNA oder cccDNA wurden mit einem Light Cycler v2.0 (Roche Diagnostics) in einem 20-μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, das 100 ng DNA, 3 mmol/l MgCl2, 0,5 μmol enthielt /L-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Ergänzungstabelle 2) und 0,75 μmol/L 5'-FAM-markierte und 3'-TMR-markierte TaqMan-Sonde (Ergänzungstabelle 2). Als Quantifizierungsstandards wurden serielle Verdünnungen eines Plasmids verwendet, das ein monomeres HBV-Insert (Alfa Wasserman) enthielt. Die Amplifikation der gesamten intrahepatischen HBV-DNA wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 50 Zyklen von 95 °C für 10 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 10 Sekunden und 40 °C für 2 Min. Vor der qRT-PCR von cccDNA wurden Aliquots der Leber-DNA-Extrakte 2 Stunden lang bei 37 °C mit 10 U plasmidsicherer DNase (Epicentre, Madison, WI) behandelt. Die Amplifikation der cccDNA wurde dann wie folgt durchgeführt: 10 Minuten bei 95 °C, 10 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 62 °C und 20 Sekunden bei 72 °C, gefolgt von 2 Minuten bei 40 °C. Um die Anzahl der in jeder Leberprobe vorhandenen viralen Genome zu normalisieren, wurde die Anzahl der haploiden Genome mithilfe eines β-Globin-Gen-Kits (Light Cycler-Control Kit DNA; Roche Diagnostics) bewertet. Für die HBV-RNA-Analyse wurden 2 μg DNase-behandelte RNA unter Verwendung des SuperScript First-Strand-Synthesesystems für RT-PCR (Invitrogen) revers transkribiert und amplifiziert. Zwei Mikroliter cDNA wurden durch qRT-PCR (Light Cycler; Roche Diagnostics) unter Verwendung von Primern und Sonden quantifiziert, die zur spezifischen Quantifizierung der HBV-Prägenom-RNA (pgRNA) entwickelt wurden (Ergänzungstabelle 2). Zur Quantifizierung der NTCP-mRNA wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung des SuperScript First-Strand-Synthesesystems für RT-PCR (Invitrogen) durchgeführt. Quantitative PCR-Reaktionen wurden mit SYBR Green (SsoFast EvaGreen Supermix, Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die Reaktionen wurden auf einem Light Cycler-Thermocycler (Roche Diagnostics) mit den in der Ergänzungstabelle 2 angegebenen Oligonukleotidprimern durchgeführt. Zur Normalisierung der RNA-Proben wurde das h-G6PDH Housekeeping-Gen Light Cycler-Set (Roche Diagnostics) verwendet. Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt und dreimal wiederholt.

Die menschliche Hepatomzelllinie PLC/PRF/5 (SIGMA, Katalognummer 85061113, Chargennummer: 10D004), die mehrere integrierte HBV-DNA-Fragmente enthält, die HepG2-Zelllinie (ATCC, Katalognummer HB-8065TM) und die Vero-Zelllinie (bereitgestellt). von Prof. Maria Teresa Sciortino) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit GlutaMAX, 10 % FBS, 200 Einheiten/ml Penicillin und 200 μg/ml Streptomycin gehalten. Die HepAD38-Zelllinie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Cristopher Seeger), die von HepG2-Zellen abgeleitet ist und das HBV-Genom (Subtyp ayw) unter einem Tetracyclin-induzierbaren Promotor32 enthält, wurde in DMEM/F12 mit GlutaMAX, 10 % FBS, 200 Einheiten kultiviert /ml Penicillin, 200 µg/ml Streptomycin und 0,3 µg/ml Tetracyclin. In HepAD38-Zellen induziert die Entfernung von Tetracyclin die Produktion von HBV-RNA und die Sekretion virusähnlicher Partikel in das Medium32. PLC/PRF/5-, HepG2-, HepAD38- und Vero-Zelllinien wurden bei der Hoechst 33258-Färbung negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Zur Identifizierung der HBV-DNA-Integration haben wir eine zuvor beschriebene Integrationssequenzierungsmethode modifiziert, um die HIV-Integration zu untersuchen21. Genomische DNA wurde aus allen Gewebeproben durch Standard-Proteinase-K-Lyse und Phenol-Chloroform-Extraktion wie oben beschrieben gewonnen. Um die Anzahl der Leberzellen in jeder Gewebeprobe zu bestimmen, haben wir das Beta-Globin-Gen mit einem Light Cycler v2.0 und einem Light Cycler-Control Kit DNA (beide Roche Diagnostics) quantifiziert. Für jede Probe wurde aus 30 Millionen Zellen isolierte genomische DNA durch Ultraschallbehandlung bei 30 % Leistung für drei Zyklen (15″ an/15″ aus) mit einem SONOPULS-Ultraschallhomogenisator (Bandelin) fragmentiert, um eine 100–1000-bp-DNA-Verteilung zu erhalten Fragmente. Die DNA wurde dann in Mikrozentrifugenröhrchen in 6 Aliquots zu je 5 μg aufgeteilt und anschließende Reaktionen wurden einzeln mit diesen 5 μg-Aliquots durchgeführt. Die DNA wurde mit dem End-It DNA Repair Kit (Epicentre) geglättet und mit MinElute Reaction Clean-up (Qiagen) gereinigt. Der abgestumpften DNA wurde ein Adenosinschwanz unter Verwendung von 5 μl NEB-Puffer 2 (10 ×), 1 μl dATP (10 mM) und 2 μl Klenow-Fragment 3- > 5 exo− (5000 U/ml) (New England Biolabs, Ipswich) hinzugefügt , MA) für 1 h bei 37 °C. Alle Reaktionen wurden mit einem MinElute Reaction Clean-up Kit (Qiagen) gereinigt. Jedes Aliquot der abgestumpften DNA-Fragmente mit A-Schwanz wurde dann mit 4 μl pLinker, 5 μl NEB T4-DNA-Ligasepuffer und 1 μl T4-DNA-Ligase (2 × 106) an 200 pmol annealte Linker (LinkerTop + LinkerBottom) (Ergänzungstabelle 2) ligiert U/mL, hohe Konzentration) (New England Biolabs) für 1 Stunde bei 25 °C und dann über Nacht bei 16 °C. Die Ligase wurde durch 20-minütige Inkubation bei 70 °C inaktiviert und die Reaktionen wurden mit einem MinElute Reaction Clean-up Kit (Qiagen) gereinigt. Schließlich wurden alle sechs Reaktionen gepoolt und die gepoolte Linker-ligierte DNA in zwei gleiche Teile aufgeteilt, um eine durch halbverschachtelte Ligation vermittelte PCR mit Vorwärts- oder Rückwärts-HBV-Primern durchzuführen (Abb. 1 und Ergänzungstabelle 2). Die Vorwärts- und Rückwärtsanreicherungssequenzen wurden im weiteren Verlauf des Protokolls getrennt gehalten. Die DNA wurde in 1-µg-Aliquots aufgeteilt; Jedes Aliquot wurde mit 20 µL Phusion HF-Puffer (5×), 3 µL dNTPs (10 mM), 1 µL biotinyliertem Forward- (20 µM) oder Reverse-HBV-Primer (Ergänzungstabelle 2) (2,5 µM), 1 µl Phusion Taq ( 2000 U/ml) (New England Biolabs) und H2O auf 50 μL. Einzelprimer-PCRs wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 1 Minute; 12 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 65 °C für 30 s und 72 °C für 45 s; 72 °C für 1 Minute); und Halten bei 4 °C. Jedes Röhrchen wurde dann mit 1 μl pLinker (Ergänzungstabelle 2) (2,5 μM) versetzt und zusätzlichen PCR-Zyklen wie folgt unterzogen: 98 °C für 1 Minute; 35 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 65 °C für 30 s und 72 °C für 45 s; 72 °C für 5 Min.; und Halten bei 4 °C. Vorwärts- und Rückwärts-PCRs wurden mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Die gereinigten Produkte wurden auf einem 2 %igen Agarosegel gut aufgetrennt und Fragmente von 300–1000 bp herausgeschnitten. Die DNA wurde mit einem QIAquick-Gelextraktionskit gereinigt und die gelbasierte Größenauswahl und Reinigung wurde einmal wiederholt. Dann wurden 100 μl magnetische T1-Streptavidin-Kügelchen (Invitrogen) zu jedem Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Produkt gegeben und die Mischung 1 Stunde lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden magnetisch isoliert, dreimal in 500 μL 1× B&W-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) und einmal in H2O gewaschen und in 50 μL H2O resuspendiert. Anschließend wurden 25 μL der Perlen aus jeder der Vorwärts- und Rückwärts-PCRs separat mit 10 μL Phusion HF-Puffer (5×), 1,5 μL dNTPs (10 mM), 1 μL Vorwärts- (20 μM) oder Rückwärts-MiSeq-HBV-Primer gemischt ( 20 μM), 1 μL Vorwärts- oder Rückwärts-MiSeq-pLinker (20 μM) (alle MiSeq-Primer enthalten einen Adapter für die Oberflächentemperung von Illumina-Flusszellen) (Ergänzungstabelle 2), 0,5 μL Phusion Taq (2000 U/ml) und 11 μL H2O und einer PCR unterzogen (98 °C für 1 Minute, 35 Zyklen von 98 °C für 10 Sekunden, 65 °C für 40 Sekunden und 72 °C–40 Sekunden, gefolgt von 72 °C für 5 Minuten und Halten bei 4 °C). Die PCR-Produkte wurden magnetisch von den Perlen getrennt und mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigt. Die mit dem Adapter ligierten Fragmente wurden durch 25 PCR-Zyklen mit den Illumina-Primern Index 1 und Index 2 wie folgt angereichert: 98 °C für 1 Minute, 25 Zyklen von 98 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 s) und 72 C° für 5 min. Vorwärts- und Rückwärtsbibliotheken für dieselbe Probe wurden in äquimolaren Verhältnissen gemischt und durch 250-bp-Paired-End-Sequenzierung unter Verwendung eines Illumina MiSeq sequenziert. Insgesamt 340 Integrationsbibliotheken wurden aus Lebergewebeproben der neun analysierten Personen (7 Patienten mit HBV-bedingtem HCC und 2 HBsAg-negativen Personen als Kontrolle) und aus den Zelllinien PLC/PRF/5, HepAD38 und Vero erstellt.

Um unsere HBV-Integrationssequenzierungsstrategie zu verifizieren, haben wir 60 Bibliotheken unter Verwendung von Leber-DNA von zwei HBV-nicht infizierten Patienten und HBV-negativen Vero-Zellen erstellt. Um die Sättigung unseres Ansatzes zu analysieren, wurden außerdem zwei separate Integrationsbibliotheken unter Verwendung identischer Proben der beiden HBV-nicht infizierten Patienten erstellt. Weder bei nicht infizierten Patienten noch bei Vero-Zellen wurden Sequenzen gewonnen, die viralen Integrationsstellen zugeordnet waren. Der HBIS-Ansatz wurde auch durch die Analyse der HBV-Integration in PLC/PRF/5-Hepatomzellen verifiziert, die mehrere integrierte HBV-DNA-Fragmente enthalten und mit verschiedenen molekularen Ansätzen, einschließlich der empfindlichsten NGS-Strategien, umfassend untersucht wurden56,58. In dieser Zelllinie wurden insgesamt 104 HBV-Integrationsstellen nachgewiesen. Bei zwölf der 104 Standorte handelte es sich um HBV-Integrationshaltepunkte, die durch mindestens drei Lesevorgänge abgedeckt wurden (Ergänzungstabelle 3 und Ergänzungsdaten 4). Unter diesen 12 einzigartigen Integrationsereignissen wurden zuvor beschriebene virale Integrationen in der TERT-Promotorregion, in den Genen MVK, CCDC57 und UNC5D und stromabwärts des STARD13-Gens nachgewiesen56,58,67. Die in die Promotorregion des TERT-Gens integrierte HBV-DNA enthielt eine Sequenz [Nukleotid (nt) 1260–1391] der ENH1/X-Promotorregion. In den Genen MVK und CCDC57 enthielten die HBV-Integranten zwei unterschiedliche Sequenzen des S-Gens (nt 711–817 bzw. nt 491–456). Im UNC5D-Gen enthielt der HBV-Integrant eine Sequenz des Core-Gens (nt 2436–2392) (Ergänzungstabelle 3 und Ergänzungsdaten 4). Darüber hinaus wurden andere HBV-Integrationsstellen in PLC/PRF/5-Zellen identifiziert, darunter das Ninein Like (NINL)-Gen, LOC105375716 ncRNA, das TBC1-Domänenfamilienmitglied 8 (TBC1D8)-Gen, das ribosomale Protein S23-Pseudogen 4 (RPS23P4) und ncRNAs LOC105374110 und LOC101929814 (Ergänzungstabellen 3 und Ergänzungsdaten 4). Virusintegrationen im TERT-Promotor und im CCDC57-Gen wurden durch PCR und Sanger-Sequenzierung bestätigt (ergänzende Abbildung 7).

Wie oben beschrieben isolierte genomische DNA wurde seriell verdünnt und einer verschachtelten PCR mit genomspezifischen Primern und HBV-spezifischen Primern (Ergänzungstabelle 2) unter Verwendung von HotStart Taq Polymerase (Qiagen) (98 °C für 14 Minuten, 40 Zyklen bei 98 °C) unterzogen für 30 s, 55 °C für 30 s, 2 °C für 30 s und 72 °C für 5 min). Die Produkte wurden durch Gelelektrophorese isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Für jedes PCR-Amplikon verwendeten wir einen Applied Biosystems 3500 DNA-Analysator, um eine Farbstoff-Terminator-Sanger-Sequenzierung durchzuführen.

Gesamt-RNAs wurden aus gefrorenen Tumoren oder gepaarten benachbarten Nicht-Tumorproben unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die Gesamtqualität und -integrität der RNA wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara, CA, USA) bewertet. Die Sequenzierung wurde auf der HiSeq 2500-Plattform unter Verwendung des TruSeq Stranded mRNA-Kits (Illumina) durchgeführt.

Um HBV-Integrationsstellen im menschlichen Genom zu erkennen, wurden zunächst rohe Paired-End-Reads (2 × 250 bp) von Illumina verarbeitet, um Adapter und Basen geringer Qualität mit dem Trimmomatic-Programm (v.0.36)68 und den folgenden Optionen zu entfernen: a gleitend Fenster von 5 bp, einem durchschnittlichen Basisqualitätswert von 16 und einer minimalen Leselänge von 35 bp. Anschließend wurde die BWA-Software (Version: 0.7.12-r1039)69 verwendet, um die sauberen Reads (Paired-End- und/oder ungepaarte Reads) mit einem benutzerdefinierten Referenzgenom abzugleichen, einschließlich der menschlichen GRCh38.p10-Referenz (GenBank-Zugang: GCA_000001405.25). ) und der HBV-Genom-Genotyp D (GenBank-Zugang: NC_003977.2). Das Picard-Tool (Version 2.22.0) (http://broadinstitute.github.io/picard) wurde verwendet, um optische Duplikat-Lesevorgänge aus den BAM-Dateien zu entfernen; Die SAMtools-Software70 wurde verwendet, um chimäre Lesevorgänge zu extrahieren (SAM-Flag 2048; zusätzliche Ausrichtung 0×800). Anschließend wurde das BEDTools-Dienstprogramm25 verwendet, um primäre und sekundäre Kartierungskoordinaten zu extrahieren, um die Anzahl der im Hybridgenom auftretenden Integrationsereignisse korrekt zu zählen (die Flagge -cigar wurde im bamtobed-Tool verwendet). Die resultierenden genomischen Koordinaten, einschließlich chromosomaler Positionen im Zusammenhang mit der Integration von HBV-DNA in das menschliche Genom, wurden dann verwendet, um Lesevorgänge im Zusammenhang mit jedem Integrationsereignis abzurufen und die chimären Sequenzen mithilfe der Software Cap371 und cd-hit72 zu rekonstruieren. Die zusammengesetzten Chimären wurden mithilfe des BLAST-Algorithmus73 mit den folgenden Optionen wieder auf das Hybridgenom abgebildet: task=blastn-short, dust=no, soft_masking=false, word_size=7, Penalty = -3, Belohnung=2, Gapopen=5, Lückenerweiterung=2. Die Mikrohomologie wurde durch DNA-Kartierung jeder Chimäre sowohl im menschlichen als auch im HBV-Genom bestimmt.

Alle identifizierten mutmaßlichen Integrationsstellen wurden herausgefiltert und nur die chimären Integrationen, die durch mindestens 3 Lesevorgänge abgedeckt waren, die der flankierenden Virussequenz mit mindestens 32 bp zugeordnet waren, wurden beibehalten. Im Durchschnitt machten Chimären 0,03 % (Bereich: 0,0045–0,48) der Gesamtzahl der qualitativ hochwertigen Messwerte aus. Alle oben beschriebenen Bioinformatik-Tools wurden in eine automatische Rechenpipeline zur genauen und effizienten Erkennung viraler Integrationsereignisse im menschlichen Genom integriert, die im GitHub-Repository verfügbar ist (https://github.com/DomeJoyce/HBVIF).

Darüber hinaus wurden Integrationen im Zusammenhang mit mutmaßlichen mitochondrialen Genen doppelt überprüft, indem bekannte NUMTs, die in Lit. angegeben sind, auf die schwarze Liste gesetzt wurden. 74 und in Lit. 75; Anschließend haben wir diese NUMTs mit unseren erkannten mitochondrialen Integrationen abgeglichen, um zu bestätigen, dass die Integrationen ordnungsgemäß im Mitogenom und nicht in den nuklearen Mitochondriensequenzen lokalisiert waren. Um schließlich die Gesamtheit der bisher gemeldeten mitochondrialen Integrationsereignisse zu berücksichtigen, haben wir aus dieser Studie und anderen Studien16,60 alle HBV-Integrationsereignisse gesammelt, die im Mitogenom auftreten. Alle von solchen Ereignissen betroffenen Genomregionen wurden in den Ergänzungsdaten 5 und in der Ergänzungsabbildung 8 angegeben.

Für jede erkannte virale Integrationsstelle wurden alle unterstützenden Lesevorgänge mithilfe des MAFFT-Aligners76 (verwendete Optionen:–localpair,–reorder,–maxiterate 1000) ausgerichtet, um die genaue Position des Bruchpunkts auf Nukleotidebene manuell zu überprüfen. Eine Integrationsstelle galt als klonal erweitert, wenn die meisten Lesevorgänge (≥92 %), die das Integrationsereignis unterstützten, einen identischen Haltepunkt zeigten, der von identischen Sequenzmotiven flankiert wurde. Daher wurden alle identifizierten HBV-Integrationsereignisse in zwei Kategorien eingeteilt: klonale Integrationen und einzelne Integrationen. Für jedes Chromosom wurde der Chi-Quadrat-Test verwendet, um das Vorhandensein statistisch signifikanter Unterschiede (P-Wert-Schwelle ≤ 0,05) in der Anzahl der Integrationsereignisse zwischen den Tumor- und Nicht-Tumorproben zu bestimmen. Darüber hinaus wurde der Chi-Quadrat-Test eingesetzt, um statistisch signifikante Unterschiede in der Verteilung der HBV-Integrationsstellen zwischen menschlichen Chromosomen zu ermitteln. Der nichtparametrische Kombinationstest (NCP) wurde angewendet, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer HBV-Integration in jedes einzelne Chromosom zu beurteilen.

Die Identifizierung von Hotspot-Standorten wurde mit der BEDTools-Suite25 durchgeführt. Die Monte-Carlo-Simulation wurde durch zufälliges Mischen der Genompositionen aller Integrationsstellen (100, 1000 und 10.000 Mal) mit dem BEDTools-Shuffle-Dienstprogramm25 durchgeführt. Anschließend verglichen wir die beobachtete Anzahl der Integrationen mit der mittleren Anzahl der Integrationen in der randomisierten Liste. Wir haben die Anreicherung bewertet, indem wir die Häufigkeit der beobachteten Ereignisse gezählt haben, die gleich oder höher als die Anzahl der randomisierten Ereignisse geteilt durch n = 100, 1000 oder 10.000 war.

Um festzustellen, ob ein bestimmtes Sequenzmotiv menschlichen oder viralen Ursprungs in den chimären Sequenzen überrepräsentiert war, verwendeten wir die Software HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer) und die Datensätze, die dem Mensch-Mensch-Virus entsprechen –Chimäre Sequenzen von Viren und Humanviren. Insbesondere wurde jeder chimäre Datensatz separat analysiert und für die statistische Analyse wurden die entsprechenden genomspezifischen Daten (menschliches, HBV- und hybrides Mensch-Virus-Genom) als Hintergrundsequenzen verwendet.

Nur aus Tumorgewebeproben der Patienten 0501, 0504 und 0505 war ausreichend Material zur Durchführung einer subzellulären Fraktionierung und Mitochondrienisolierung verfügbar. Zusätzlich zu den Tumorgeweben dieser Patienten wurden eine subzelluläre Fraktionierung und Mitochondrienisolierung an Lebergewebeproben von fünf CHB durchgeführt Patienten mit hohem HBV-Replikationsgrad, ein HBV-negativer Patient und HepG2- und HepAD38-Zellen nach der zuvor in Lit. beschriebenen Methode. 77. Kurz gesagt, 150 mg gefrorenes Lebergewebe von jedem Patienten und 8 × 107 HepG2- oder HepAD38-Zellen wurden zur Mitochondrienisolierung verwendet. Die Lebergewebeproben wurden in kaltem MitoPrep-Puffer (0,225 M Mannitol, 0,075 M Saccharose, 20 mM HEPES pH 7,4) mit 1 mM EDTA und 0,5 mM PMSF unter Verwendung eines TissueRuptor-Homogenisators (Qiagen) homogenisiert. HepG2- und HepAD38-Zellen wurden durch 2-minütige Zentrifugation bei 2000 × g bei Raumtemperatur gesammelt, mit PBS 1 × pH 7,4 (Lonza) gewaschen und in MitoPrep-Puffer (0,225 M Mannitol, 0,075 M Saccharose, 20 mM HEPES pH 7,4) resuspendiert 1 mM EDTA und 0,5 mM PMSF gemischt und mit einer 23-G-Nadel homogenisiert. Die Homogenate wurden dem gleichen Protokoll zur nuklearen und mitochondrialen Isolierung unterzogen. Konkret wurden die Gewebe- und Zellhomogenate 10 Minuten lang bei 4 °C und 800 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein neues Röhrchen überführt und auf Eis gestellt, und die Pellets wurden mit einer 27-G-Nadel erneut homogenisiert, in MitoPrep-Puffer resuspendiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 800 × g zentrifugiert. Die kernhaltigen Pellets wurden zur anschließenden Analyse bei –20 °C gelagert. Die beiden Überstände jeder Probe wurden gepoolt und 5 Minuten lang bei 4 °C und 800 × g zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden in neue Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 4 °C und 11.000 × g zentrifugiert. Die erhaltenen Überstände, die die zytoplasmatischen Fraktionen enthielten, wurden zur anschließenden Analyse bei –20 ° C gelagert; Die mitochondrialen Pellets wurden in 200 µL MitoPrep-Puffer resuspendiert und mit 300 U Mikrokokken-Nuklease S7 (Thermo Scientific), 10 mM CaCl2 und 1 µL 10 mg/ml Digitonin (Sigma-Aldrich) 25 Minuten lang bei 27 °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 5 mM EDTA gestoppt. Die Mitoplasten wurden 4 Minuten lang bei 4 °C mit 11.000 × g pelletiert und für die DNA-Extraktion, RNA-Extraktion, In-vitro-RNA-Importtests oder RNA-Pulldown-Tests verwendet.

Die preS1- und pcDNA3.1 gerichteter TOPO-Vektor (Life Technologies), der pcDNA-preS1 und pcDNA-X erzeugt. Die HBV-Genomregionen, die der Enkapsidierungssignal-„Epsilon“-Sequenz der prägenomischen RNA (pgRNA) und dem Stammschleifen-α (SLα) des posttranskriptionellen regulatorischen Elements (PRE) entsprechen, wurden ebenfalls durch PCR amplifiziert und die resultierenden 287- bp- und 680-bp-Fragmente (Nukleotidpositionen 1781–2068 bzw. 670–1350) wurden kloniert, um pcDNA-Epsilon und pcDNA-SLα zu konstruieren. Darüber hinaus wurde die humane mitochondriale COX3-RNA-Sequenz (nt-Position 9397–9796) aus HepG2-Zellen PCR-amplifiziert und das erhaltene 399-bp-Fragment in den bidirektionalen TOPO-Vektor eingefügt, um pcDNA-COX3 zu erzeugen.

Die Transkripte wurden unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase (Roche Diagnostics) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Für die Biotin-markierte RNA-Synthese wurde ein Pierce 3' END Deshtiobiotinylation Kit (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die RNA wurde unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.

In-vitro-RNA-Importtests wurden in einem 200-µL-Volumen durchgeführt, das 50 µg Mitoplasten, 0,225 M Mannitol, 0,05 M Saccharose, 20 mM HEPES pH 7,4, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, 15 mM Succinat und 2 enthielt mM DTT. Nach 5-minütiger Inkubation bei 30 °C wurden 200 ng RNA zum Importpuffer gegeben und die Reaktionen wurden 10 Minuten bei 30 °C inkubiert. Als nächstes wurden 300 U Mikrokokken-Nuklease S7 und 10 mM CaCl2 zugegeben und die Proben 30 Minuten lang bei 27 °C inkubiert. Die Mischung wurde in ein neues Röhrchen überführt und die Mitoplasten wurden bei 11.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C sedimentiert, in Harnstoff-SDS-Ladepuffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, 5 mM EDTA, 25 % Glycerin, 0,01 % Bromphenolblau, 10 μg/ml Proteinase K und gesättigter Harnstoff) und 5 Minuten lang auf 50 °C erhitzt. Die RNA und Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgelöst. Die Proben wurden dann mit einem North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) analysiert.

Von pcDNA-preS1, pcDNA-SLα, pcDNA-X, pcDNA-Epsilon und pcDNA-COX3 transkribierte RNA wurde am 3'-Ende unter Verwendung eines Pierce 3' END Deshtiobiotinylation Kit (Thermo Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Mitoplast-Pellets aus 8 × 107 HepG2-Zellen wurden für RNA-Pulldown-Assays verwendet. Die Pellets wurden in 200 µL MitoPrep-Puffer resuspendiert und mit 300 U Mikrokokken-Nuklease S7 (Thermo Fisher Scientific) und 10 mM CaCl2 20 Minuten bei 27 °C inkubiert. Die Protoplasten wurden dann 5 Minuten lang bei 4 °C und 11.000 × g pelletiert. Die Pellets wurden in 30 µL MitoPrep-Puffer gelöst und 2 s lang auf Eis beschallt. Der RNA-Pulldown wurde mit einem Pierce Magnetic RNA-Protein Pulldown-Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, für jeden Assay wurden 50 pmol biotinylierte RNAs oder Kontroll-RNA mit 50 μl vorgewaschenen Streptavidin-Agarose-Kügelchen 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Die RNA-gebundenen Perlen wurden mit Lysaten aus Mitoplasten inkubiert und die eluierten Proteine ​​wurden durch Western Blot nachgewiesen.

Die Zellen wurden zweimal in 1x PBS, pH 7,4, gewaschen und in Triton X-100 1x Zelllysepuffer (Cell Signaling Technology), ergänzt mit 1 mM PMSF, lysiert. Mitochondrien wurden direkt in 1× SDS-Ladepuffer lysiert. Proteinlysate (50 μg) sowie die in vitro-Pulldown-eluierten Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Immobilon-P-Membranen (Millipore) übertragen und 1 Stunde lang mit 5 % fettfreier Blotting Grade Blocker-Milch inkubiert (Bio-Rad) TBS-T und dann über Nacht mit Primärantikörpern in 5 % BSA bei 4 °C oder für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur. Zu den verwendeten Antikörpern gehörten Kaninchen-Anti-PNPase (GTX118737, 1:500, GeneTex), Kaninchen-Anti-Mortalin (3593, 1:500, Cell Signaling Technology) und Anti-β-Tubulin-Maus (86298, 1:1000, Cell Signaling Technology). , Maus-Anti-Hsp90 (ab13492, 1:500, Abcam). Der Nachweis erfolgte mit Anti-Kaninchen- bzw. Anti-Maus-IgG (AP307P, AP308P, 1:3000, 1:1000, Millipore). Die immunreaktiven Signale wurden unter Verwendung des Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und kategoriale Variablen als absolute Häufigkeit und Prozentsatz dargestellt. Zur Untersuchung der Variablenverteilung wurde ein nichtparametrischer Ansatz angewendet, der durch den Kolmogorov-Smirnov-Test bestätigt wurde. χ2 oder exakte Fisher-Tests wurden angewendet, um Gruppen kategorialer Variablen zu vergleichen. Für den Vergleich zwischen Gruppen numerischer Variablen wurde der Student-t-Test angewendet. Der NPC-Test mit der Fisher-Kombinationsfunktion wurde angewendet, um die P-Werte aus verschiedenen Vergleichen zu kombinieren. Die statistischen Analysen wurden mit SPSS 22.0 für das Windows-Paket durchgeführt. Ein AP-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Tests waren zweiseitig. Echtzeit-PCR-Quantifizierungsexperimente, RNA-Import-Assay, RNA-Pulldown-Analyse und Western-Blot-Experimente wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in diesem Artikel gemeldeten Sequenzierungsdaten wurden in der NCBI-SRA-Datenbank (DNA-seq-Zugang [PRJNA650273]; SRA-Studie: SRP283983) hinterlegt. Die Autoren erklären, dass alle anderen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich sind. Unbeschnittene Scans finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 9–13.

Die wichtigsten Softwareprogramme oder Algorithmen, die bei unserer Analyse der Sequenzierungsdaten verwendet werden, sind unter „Methoden“ aufgeführt. Alle in „Methoden“ beschriebenen Bioinformatik-Tools wurden in eine automatische Rechenpipeline integriert, die im GitHub-Repository (https://github.com/DomeJoyce/HBVIF) verfügbar ist.

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Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium des italienischen Ministeriums für Bildung, Universität und Forschung (MIUR), PRIN 2017 (2017MPCWPY_003) an G. Raimondo unterstützt.

Giuseppina Raffa

Derzeitige Adresse: Labor für Molekulare Hepatologie, Universitätsklinikum Messina, Messina, Italien

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Domenico Giosa, Daniele Lombardo.

Abteilung für klinische und experimentelle Medizin, Universitätsklinikum Messina, Messina, Italien

Domenico Giosa, Daniele Lombardo, Valeria Chines, Giuseppina Raffa, Francesca Casuscelli di Tocco, Deborah D'Aliberti, Carlo Saitta, Giovanni Raimondo und Teresa Pollicino

Labor für Molekulare Hepatologie, Universitätsklinikum Messina, Messina, Italien

Domenico Giosa, Daniele Lombardo, Cristina Musolino, Valeria Chines, Francesca Casuscelli di Tocco, Deborah D'Aliberti, Giuseppe Caminiti und Teresa Pollicino

Abteilung für Humanpathologie, Universitätsklinikum Messina, Messina, Italien

Cristina Musolino & Giuseppe Navarra

Fakultät für Wirtschaftswissenschaften, Universität Messina, Messina, Italien

Angela Alibrandi

Sequencia Biotech Sl, Barcelona, ​​​​Spanien

Riccardo Aiese Cigliano

Abteilung für ChiBioFarAm, Universität Messina, Messina, Italien

Horace Romeo

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TP und G. Raimondo haben die Studie konzipiert. TP, DG, DL, DD, CM, G. Raffa, GC, RAC und OR trugen zu Pipelines und/oder Datenmanagement bei. DG, RAC und OR analysierten die Sequenzierungsdaten. DG, OR und TP analysierten und interpretierten die Daten. DG und AA führten bioinformatische und statistische Analysen durch. CS und G. Raimondo analysierten die klinischen Daten. CM, VC, G. Raffa, FCT und DD führten die Sequenzierung durch. DL, CM, G. Raffa und VC führten Laborexperimente durch. GN stellte Tumorproben zur Verfügung. TP hat das Manuskript mit Unterstützung aller Autoren verfasst. TP betreute das Projekt.

Korrespondenz mit Teresa Pollicino.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Valeria Naim und Christina Karlsson Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Giosa, D., Lombardo, D., Musolino, C. et al. Mitochondriale DNA ist ein Ziel der HBV-Integration. Commun Biol 6, 684 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05017-4

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Eingegangen: 29. Juni 2022

Angenommen: 05. Juni 2023

Veröffentlicht: 03. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05017-4

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