Periportale Steatose bei Mäusen beeinflusst bestimmte Parameter des perizentralen Arzneimittelstoffwechsels

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21825 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Über den Einfluss morphologischer Störungen in bestimmten Zonen auf die Stoffwechselzonierung ist wenig bekannt. Kürzlich wurde beschrieben, dass periportale Fibrose die Expression von CYP-Proteinen beeinflusst, einer Reihe perizentraler Arzneimittel metabolisierender Enzyme. Hier haben wir untersucht, ob eine periportale Steatose einen ähnlichen Effekt haben könnte. Periportale Steatose wurde bei C57BL6/J-Mäusen durch die Fütterung einer fettreichen Diät mit niedrigem Methionin-/Cholingehalt über zwei oder vier Wochen induziert. Der Schweregrad der Steatose wurde mittels Bildanalyse quantifiziert. Triglyceride und CYP-Aktivität wurden in photometrischen oder fluorometrischen Tests quantifiziert. Die Verteilung von CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6 und CYP2E1 wurde durch Immunhistochemie sichtbar gemacht. Die pharmakokinetischen Parameter der Testmedikamente wurden nach Injektion eines Medikamentencocktails (Koffein, Codein und Midazolam) bestimmt. Das Ernährungsmodell führte zu einer mittelschweren bis schweren gemischten Steatose, die auf periportale und mittelzonale Bereiche beschränkt war. Periportale Steatose hatte keinen Einfluss auf die zonale Verteilung der CYP-Expression, aber die Aktivität ausgewählter CYPs war mit dem Schweregrad der Steatose verbunden. Die Elimination von Koffein war bei mikrovesikulärer Steatose beschleunigt, während die Elimination von Midazolam bei makrovesikulärer Steatose verzögert war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die periportale Steatose die Parameter des perizentralen Arzneimittelstoffwechsels beeinflusste. Diese Beobachtung erfordert weitere Untersuchungen des hochkomplexen Zusammenhangs zwischen Steatose und Arzneimittelstoffwechsel sowie den zugrunde liegenden Signalmechanismen.

Über morphologische Veränderungen in bestimmten lobulären Zonen, die die Leberfunktion beeinflussen, wie z. B. den Cytochrom p450 (CYP)-abhängigen Arzneimittelstoffwechsel, ist wenig bekannt.

Cytochrom-p450-Enzyme sind eine Superfamilie von Proteinen, die die Oxidation organischer Substanzen katalysieren, ein wichtiger Schritt bei der Entgiftung von Medikamenten1,2. CYP-Enzyme kommen in allen wichtigen Organen vor, überwiegend jedoch in der Leber2. Hepatische CYP-Enzyme werden normalerweise in der perizentralen Region des Leberläppchens exprimiert3. Dies ist von Bedeutung, da die verschiedenen Stoffwechselwege und -funktionen einer räumlichen Organisation entlang der portozentralen Achse im Leberläppchen unterliegen, ein Phänomen, das als metabolische Zonierung4,5,6,7 bezeichnet wird.

Es scheint offensichtlich, dass Nekrose oder Schädigung der perizentralen Region die perizentrale Expression sowie die Aktivität von CYP-Enzymen beeinflussen8. Die Auswirkungen periportaler Schäden oder Veränderungen auf perizentrale Prozesse sind jedoch eher unklar. Es gibt erste Hinweise darauf, dass periportale Veränderungen auch Auswirkungen auf perizentrale Stoffwechselprozesse haben können. Ghallab et al. zeigten kürzlich, dass sowohl perizentrale als auch periportale Fibrose einen ähnlichen Einfluss auf die zonierte Expression von hepatischen CYP-Proteinen hatten. In beiden Fällen führte die Fibrose zu einem leichten bis vollständigen Verlust der perizentralen CYP-Expression8. Sie untersuchten jedoch weder die CYP-Aktivität in noch ex vivo.

Erkrankungen wie die Fettleber können einen Einfluss auf die zonierte Expression von CYP-Enzymen und möglicherweise auch auf die zonierte Funktion haben. Beispielsweise berichten experimentelle und klinische Studien übereinstimmend, dass CYP3A4 in der Fettleber entweder in Bezug auf Aktivität, Expressionsniveau oder Pharmakokinetik (PK) herunterreguliert ist9,10,11,12,13. Im Gegensatz dazu besagen die meisten, aber nicht alle Studien an Menschen und Tieren, dass CYP2E1 bei nichtalkoholischer Steatohepatitis entweder in Bezug auf Aktivität oder Expression hochreguliert ist9,10,14,15,16. Im Gegensatz dazu wurde bei Patienten auch beobachtet, dass CYP2E1 hinsichtlich der Protein- und mRNA-Expression herunterreguliert ist17. Darüber hinaus war CYP2E1 bei Ratten, die einer Diät mit Methionin-Cholin-Mangel (MCD) unterzogen wurden, in Bezug auf Aktivität und mRNA-Expression herunterreguliert12.

Insgesamt wird der Einfluss der Steatose auf den Arzneimittelstoffwechsel kontrovers diskutiert18 (Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle S2). Bisher wurde einer klaren Beschreibung des Schweregrads, der Art und der Zonierung der Fettansammlung nicht viel Aufmerksamkeit geschenkt. Diese Faktoren beeinflussen möglicherweise das CYP-Expressionsmuster und/oder die CYP-Aktivität und folglich die CYP-vermittelte Funktion wie die Arzneimittelmetabolisierung.

Das Ziel unserer Arbeit bestand darin, den Einfluss der periportalen Steatose auf den perizentralen Arzneimittelstoffwechsel zu untersuchen und sich dabei auf die wichtigen CYP-Isoformen CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4 zu konzentrieren. Unsere Studie ist einzigartig in Bezug auf den Zusammenhang zwischen der zonalen Verteilung und dem Steatosemuster und den Schlüsselenzymen des Arzneimittelstoffwechsels. Wie oben erwähnt, berücksichtigen die meisten anderen Studien zum Arzneimittelstoffwechsel diese potenzielle Auswirkung der Steatose nicht (Ergänzungsmaterialien, Tabelle S3). Darüber hinaus wird entweder die zonale Verteilung von CYP-Enzymen oder die Gesamtaktivität und/oder Expressionsniveaus untersucht. Mit anderen Worten: Studien, die sich auf die zonale Verteilung des CYP-Expressionsmusters konzentrierten, betrafen keine hepatischen Stoffwechselstörungen wie Fettleber und deren Auswirkungen auf den CYP-vermittelten Arzneimittelstoffwechsel.

Daher ist die Untersuchung der CYP-Zonierung im komplexen Zusammenhang zwischen Steatose und Arzneimittelstoffwechsel ein neuer und unbekannter Aspekt. Dieser Aspekt scheint jedoch von Bedeutung zu sein, da sich Hinweise darauf häufen, dass periportale morphologische Veränderungen wie Fibrose bestimmte Merkmale des perizentralen Arzneimittelstoffwechsels beeinflussen können8. Unsere Studie war daher darauf ausgelegt, diesen Zusammenhang zu untersuchen.

Daher wurde eine gemischte mikro- und makrovesikuläre periportale Steatose unterschiedlichen Ausmaßes durch eine fettreiche Diät mit reduziertem Methionin-Cholin-Gehalt (HF-Diät) induziert. Um den Zusammenhang zwischen Steatose und CYP-katalysiertem Arzneimittelstoffwechsel zu quantifizieren: Im ersten Schritt wurde die Lebersteatose charakterisiert und quantifiziert. Im zweiten Schritt analysierten wir die räumliche Verteilung der Arzneimittel metabolisierenden Enzyme. Im dritten Schritt wurde die CYP-Aktivität ex vivo bewertet und die Korrelation zwischen Aktivität und Steatose-Schweregrad sowie Steatose-Muster bestimmt. Abschließend wurde eine pharmakokinetische Studie zur Beurteilung der CYP-Aktivität in vivo basierend auf einem Wirkstoffcocktail aus Midazolam für CYP3A4, Koffein für CYP1A2 und Codein für CYP2D619 durchgeführt. Aus den Arzneimitteleliminationskurven wurden pharmakokinetische Parameter berechnet und der Zusammenhang zwischen Schweregrad und Steatosemuster analysiert.

Das Fütterungsprotokoll führte zu überwiegend periportaler bis mittelzonaler Steatose, jedoch zu keinem Gewichtsverlust. Interessanterweise beobachteten wir eine recht heterogene Verteilung innerhalb und zwischen den Leberlappen (Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung S1).

Bei Tieren, die zwei Wochen lang gefüttert wurden, beobachteten wir ein gemischtes, aber überwiegend mikrovesikuläres Steatosemuster. In der unmittelbaren Umgebung des Pfortadertrakts befand sich ein schmaler Rand aus Hepatozyten mit großen Fettvakuolen. Allerdings enthielt der Großteil der Hepatozyten in der äußeren periportalen Zone und im Mittelzonenbereich mikrovesikuläre Lipidtröpfchen. Nach vierwöchiger Fütterung kehrte sich das Verhältnis von mikrovesikulärem zu makrovesikulärem Steatosemuster um. Die Hepatozyten in der periportalen Zone und einem Teil des Mittelzonenbereichs waren mit großen Fettvakuolen gefüllt. Im Gegensatz dazu gab es im mittleren bis perizentralen Bereich einen eher kleinen Hepatozytenrand, der kleine Lipidvesikel enthielt.

Die Anwendung der Steatose-induzierenden Diät führte zu einem erheblichen und signifikanten Anstieg der mittleren TG-Konzentration pro 100 mg homogenisierter Leber. In den Versuchsgruppen war die TG-Konzentration mindestens doppelt so hoch wie in der Kontrollgruppe. Wir beobachteten 192,7 nmol/100 mg Gewebe als niedrigsten Wert in den beiden Versuchsgruppen im Vergleich zu einem Mittelwert von 99,6 ± 42,3 nmol/100 mg Gewebe in der Kontrollgruppe, was zu einem hochsignifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und Versuchsgruppe führte (p = 0,0002). ), siehe Abb. 1A.

Schweregrad der Lebersteatose. (A) Gesamttriglycerid abhängig von der Ernährung. Die Gesamttriglyceridmessung zeigte in den HF-Diätgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höhere Werte, jedoch keine Unterschiede zwischen den Gruppen, die zwei bzw. vier Wochen HF-Diät erhielten; (B) Lipidtröpfchen, lipidhaltige Hepatozyten, mikrosteatotische Hepatozyten und makrosteatotische Hepatozyten, je nach Ernährung. Durch die Bildanalyse mit unterschiedlichen Algorithmen wurden spezifische Unterschiede im Schweregrad festgestellt, wenn die Tiere entweder zwei oder vier Wochen lang mit der speziellen Diät gefüttert wurden. Die Analyse der Lipidtröpfchen ergab eine deutlich größere von den Tröpfchen bedeckte Oberfläche. Eine Musteranalyse, bei der mikro- und makrovesikuläre Steatose getrennt beurteilt wurde, ergab eine auffallend und signifikant größere Oberfläche, die nach zweiwöchiger Fütterung von mikrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt war, im Gegensatz zu der deutlich größeren Oberfläche, die nach vierwöchiger Fütterung von makrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt war. Die von steatotischen Hepatozyten bedeckte Gesamtoberfläche war in beiden Gruppen ähnlich (*Signifikanzniveau < 0,05, **Signifikanzniveau < 0,01, ***Signifikanzniveau < 0,001, ****Signifikanzniveau < 0,0001, Stichprobengröße jeder Gruppe angezeigt in unten in der Leiste).

Die mittlere TG-Konzentration in der Leber von Tieren, die vier Wochen lang gefüttert wurden, war höher als bei Tieren, die zwei Wochen lang gefüttert wurden (mit 296,1 ± 91,6 nmol/100 mg Gewebe nach vier Wochen im Vergleich zu 252,8 ± 43,0 nmol/100 mg). Gewebe nach zwei Wochen. Der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (p = 0,48).

Für die histologische Quantifizierung des Schweregrads und Musters der Steatose haben wir zwei verschiedene Bildalgorithmen angewendet.

Zunächst analysierten wir die relative Oberfläche, die von Lipidtröpfchen bedeckt ist, wie es häufig bei der bildanalysebasierten Beurteilung des Schweregrads durchgeführt wird20,21. Bei Tieren, die zwei Wochen lang gefüttert wurden, lag die relative, von den Lipidtröpfchen bedeckte Oberfläche zwischen 8 und 11 %. Im Gegensatz dazu war bei Tieren, die vier Wochen lang gefüttert wurden, die relative, von Lipidtröpfchen bedeckte Oberfläche deutlich größer (p = 0,001), obwohl der absolute Unterschied in der „relativen Oberfläche“ nicht so groß war (9,3 ± 1,3 % gegenüber 13,9 ± 2,7 %). %, siehe Abb. 1B. Diese Art der Analyse unterschätzt jedoch die Auswirkungen der mikrovesikulären Steatose, da selbst eine große Anzahl von Hepatozyten mit kleinen Fettvakuolen keinen wesentlichen Beitrag zur relativen Oberfläche leistet.

Zweitens haben wir die relative Oberfläche bestimmt, die von lipidhaltigen Hepatozyten bedeckt ist, eine Analyse, die der herkömmlichen histopathologischen Beurteilung in der Klinik näher kommt. Ärzte schätzen die relative Anzahl der Hepatozyten, die Fetttröpfchen enthalten, unabhängig von der Größe22, wobei < 33 % als leichte Steatose, 33–66 % als mittelschwere Steatose und > 66 % als schwere Steatose angesehen werden. Im Gegensatz zum Rattenmodell23,24 löste die zweiwöchige Fütterungsperiode bereits eine schwere Steatose aus, wobei die relative Oberfläche, die mit fettbeladenen Hepatozyten bedeckt war, 66 % überstieg, siehe Abb. 1B. Unter Verwendung des Mustererkennungsalgorithmus zur Berechnung der Gesamtfläche, die von fettbeladenen Hepatozyten bedeckt ist, war der Unterschied zwischen den beiden Gruppen, die entweder einer zweiwöchigen oder einer vierwöchigen Induktion unterzogen wurden, nicht signifikant, wie bereits in der TG-Analyse beobachtet.

Mithilfe dieses Mustererkennungsalgorithmus konnten wir jedoch zwischen mikro- und makrovesikulärer Steatose unterscheiden. Wie oben beschrieben, war die kürzere Fütterungsdauer mit einem überwiegend mikrovesikulären steatotischen Muster verbunden. Etwa 48,6 ± 12,9 % der relativen Oberfläche waren mit mikrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt, wohingegen 20,7 ± 7,1 % von makrovesikulären steatotischen Hepatozyten eingenommen wurden, was einem Verhältnis von mikro- zu makrovesikulärer Steatose von 2,4:1 entspricht. Im Gegensatz dazu führte die längere Induktionsperiode zu einem überwiegend makrovesikulären steatotischen Muster. Nach 4-wöchiger Fütterung war ein deutlich geringerer Anteil der relativen Oberfläche (33,4 ± 10,2 %) mit mikrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt, wohingegen ein deutlich größerer Anteil von makrovesikulären steatotischen Hepatozyten eingenommen wurde (39,9 ± 8,6 %), was zu einem Verhältnis von 0,8:1. Mit anderen Worten: Das Verhältnis von mikro- zu makrovesikulärer Steatose veränderte sich erheblich.

Dieses Muster spiegelt die Entwicklung der Steatose wider, die mit der Ansammlung winziger Lipidtröpfchen im periportalen Bereich beginnt und sich in Richtung der perizentralen Zone erstreckt. Mit der Zeit und der Ansammlung von mehr Fett in den Hepatozyten wurden die Tröpfchen größer, was zu einer makrovesikulären Steatose führte, wie bereits berichtet25.

Wie erwartet wurden alle CYP-Enzyme in der perizentralen Region exprimiert, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß.

Die CYP3A4-Färbung war in den ersten 2–3 Hepatozytenlinien rund um die Zentralvene und eine mäßige Signalintensität im perizentralen Bereich des Läppchens sichtbar. Bei der Berechnung der relativen Oberfläche, die von starken und mäßigen Signalen abgedeckt wird, konnten wir keinen Unterschied in der CYP3A4-Oberfläche zwischen den drei Gruppen feststellen, siehe Abbildungen. 2 und 3.

Visualisierung der Steatose und der CYP-Expression bei normalen und experimentellen Tieren, die zwei Wochen bzw. vier Wochen HF-Diät erhielten. (A) Die HE-Färbung zeigt eine periportale Steatose mit überwiegend mikrovesikulärem Muster nach zweiwöchiger Fütterung und überwiegend makrovesikulärem Muster nach vierwöchiger Fütterung; (B) Glutaminsynthetase (GS)-Färbung zur Annotation perizentraler Hepatozyten um die Zentralvene und zur Unterscheidung periportaler von perizentralen Zonen; (C) CYP3A4-Färbung an perizentraler Stelle ohne wesentliche Unterschiede in der Verteilung positiver Signale zwischen den drei Gruppen; (D) CYP2D6-Färbung auch an perizentraler Stelle ohne wesentliche Unterschiede in der Verteilung positiver Signale zwischen den drei Gruppen; (E) CYP2D6 wird fast in den gesamten Läppchen exprimiert, mit 1–2 Linien dunkelbraun gefärbter Hepatozyten um die Zentralvene mit ähnlichem Muster in allen drei Gruppen; (F) Die Expression von CYP2E1 unterscheidet sich leicht von der von CYP3A4, wobei 4–5 Hepatozytenlinien starke Signale um die Zentralvene zeigen, auch ohne Unterschiede zwischen den Gruppen; Maßstabsbalken 250 µm.

Quantifizierung der CYP-Expression mithilfe des Mustererkennungsalgorithmus. (A–D) Kein signifikanter Unterschied im Expressionsmuster von CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6 und CYP2E1 in Bezug auf die relative Oberfläche, die von positiv gefärbten Hepatozyten bedeckt ist. Die Probengröße jeder Gruppe wird unten in der Leiste angezeigt.

Die Expression von CYP1A2 folgte einem ähnlichen Muster wie CYP3A4 mit einem starken Signal in den ersten 2–3 Linien perivenöser Hepatozyten und einem mäßigen Signal, das sich über das gesamte perizentrale Drittel des Läppchens erstreckte. Auch hier wurden Muster und Ausdehnung durch die Steatose-induzierende Diät nicht beeinflusst, siehe Abb. 2 und 3.

CYP2D6 wurde nahezu in den gesamten Läppchen exprimiert. Allerdings war die Signalintensität rund um die Zentralvene am stärksten. Wir beobachteten 1–2 Linien dunkelbraun gefärbter Hepatozyten um die Zentralvene. Die übrigen Hepatozyten zeigten im gesamten Läppchen ein mäßiges Signal. Auch das CYP2D6-Muster sowie die Extension wurden durch die Steatose-induzierende Diät nicht beeinflusst, siehe Abb. 2 und 3.

Das Muster der CYP2E1-Färbung unterschied sich geringfügig von dem von CYP3A4. Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Versuchsgruppe beobachteten wir 4–5 Linien von Hepatozyten, die Signale von starker Intensität um die Zentralvene herum präsentierten. Auch bei CYP2E1 wurden das Muster und die Ausdehnung durch die Steatose-induzierende Diät nicht beeinflusst, siehe Abbildungen. 2 und 3.

Die CYP-Aktivität im Lebergewebe wurde anhand von vier Modellreaktionen gemessen, die verschiedene Enzymkombinationen abdeckten. Wir haben zunächst den Proteingehalt pro Gramm Leber bestimmt und die Aktivität dann auf mg Protein im Gewebe bezogen. Wir beobachteten, dass der relative Proteingehalt der normalen Kontrollproben zwischen 67,4 und 79,2 mg/ml lag, siehe Abb. 4A. Im Gegensatz dazu war der relative Proteingehalt der steatotischen Proben deutlich niedriger und lag zwischen 64,0 und 69,2 mg/ml nach zweiwöchiger Fütterung und 62,2 bis 69,2 mg/ml nach vierwöchiger Fütterung.

CYP-Aktivität. (A) Die Proteinkonzentration in Leberproben war in steatotischen Proben im Vergleich zur Kontrolle statistisch signifikant niedriger, in den beiden Versuchsgruppen jedoch ähnlich; (B) Die mit dem EMND-Assay bestimmte CYP3A-Aktivität war in den Proben von Tieren mit schwerer Steatose, wie durch die Lipidtröpfchenanalyse bestimmt, deutlich niedriger; (C) Die Ergebnisse des EROD-Assays für die CYP1A-Aktivität zeigten eine deutlich geringere Aktivität in den Proben von Tieren mit schwerer Steatose; (D) Der PNPH-Assay für CYP1E1-Aktivität zeigte eine zunehmende Aktivität mit zunehmendem Schweregrad der Steatose (*Signifikanzniveau < 0,05, **Signifikanzniveau < 0,01, ***Signifikanzniveau < 0,001, ****Signifikanzniveau < 0,0001, Stichprobengröße von jede Gruppe wird unten in der Leiste angezeigt).

Die Fütterungsdauer hatte einen Einfluss auf die Aktivität von CYP3A (EMND-Assay), CYP1A (EROD-Assay) und CYP2E1 (PNPH-Assay), siehe Abb. 4, jedoch nicht auf ECOD und PROD, siehe Abb. S2. Im ersten Schritt der Analyse untersuchten wir den Einfluss der Fütterungsdauer auf die CYP-Aktivität. Die durch die EMND-Reaktion gemessene CYP3A-Aktivität sowie die durch die EROD-Reaktion bestimmte CYP1A-Aktivität waren in Lebern von Tieren, die 4 Wochen lang gefüttert wurden, im Vergleich zu Kontrollgewebe von normalen Tieren signifikant niedriger (p = 0,029 bzw. p = 0,005), siehe Abb . 4B,C. Im Gegensatz dazu war die Aktivität von CYP2E1 in den Lebern von Tieren nach Langzeitfütterung im Vergleich zur Kontrolle fast doppelt so hoch (p = 0,0003), siehe Abb. 4D.

Der Schweregrad der Steatose beeinflusste die Ex-vivo-Aktivität von CYP1A2 und CYP2E1. Im zweiten Schritt der Analyse haben wir anhand der Lipidtröpfchenergebnisse der einzelnen Tiere die lineare Korrelation zwischen dem Schweregrad der Steatose und der CYP-Aktivität berechnet. Wie von der ersten Analyse erwartet, fanden wir eine mäßige negative Korrelation zwischen der relativen, von Lipidtröpfchen bedeckten Oberfläche und der CYP3A-Aktivität, gemessen im EMND-Assay, siehe Abb. 5A1. Wir beobachteten eine starke negative Korrelation mit der CYP1A-Aktivität (EROD-Assay), siehe Abb. 5A2. Wir haben auch die starke positive Korrelation zwischen dem Schweregrad der Steatose und der CYP2E1-Aktivität bestätigt, wie im PNPH-Assay bestimmt, siehe Abb. 5A3.

Korrelation zwischen dem Schweregrad der Steatose und der CYP-Aktivität. (Reihe A) Schweregrad der Steatose, bestimmt durch Lipidtröpfchenanalyse in Prozent der Oberfläche; (Reihe B) Ausmaß der mikrovesikulären Steatose, in Prozent der Oberfläche; (Zeile C) Ausmaß der makrovesikulären Steatose, ausgedrückt in Prozent. (Spalte 1) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der Aktivität von CYP3A; (Spalte 2) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der Aktivität von CYP1A; (Spalte 3) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der Aktivität von CYP2E1. Kontrolle als magentafarbene Kreise, zwei Wochen HF-Diät als blaue Quadrate, 4 Wochen HF-Diät als grüne Dreiecke.

Das Steatosemuster beeinflusste die Ex-vivo-Aktivität von CYP1A und CYP2E1. Im dritten Schritt analysierten wir die Korrelation zwischen dem vorherrschenden Steatosemuster und der CYP-Aktivität. Im Gegensatz zur Tröpfchenanalyse korrelierte das Ausmaß der mikrovesikulären Steatose (%) nicht signifikant mit den Ergebnissen von EMND und PNPH, was hauptsächlich die Aktivität von CYP3A und CYP2E1 widerspiegelte, siehe Abb. 5B1, B3, zeigte aber eine mäßig negative Korrelation mit den Ergebnissen CYP1A-Aktivität, siehe Abb. 5B2. Darüber hinaus korrelierte das Ausmaß der makrovesikulären Steatose nicht signifikant mit CYP3A, sondern mäßig mit CYP1A, zeigte jedoch eine starke positive Korrelation mit der CYP2E1-Aktivität.

Zusammengenommen hatten bestimmte Merkmale der periportalen Steatose einen starken Einfluss auf die Aktivität von CYP-Enzymen, die sich in der perizentralen Zone des Leberläppchens befinden. Der Schweregrad der Steatose korrelierte negativ mit der Aktivität von CYP3A und CYP1A, jedoch positiv mit der Aktivität von CYP2E1. Neben dem Schweregrad hatte auch das Muster der Steatose einen Einfluss auf die CYP-Aktivität. Die makrovesikuläre Steatose korrelierte negativ mit der Aktivität von CYP1A, jedoch positiv mit der Aktivität von CYP2E1. Diese Beobachtungen deuten auf ein hochkomplexes Zusammenspiel zwischen einer Veränderung in der periportalen Zone und der molekularen Reaktion in der perizentralen Region hin.

Zunächst haben wir uns die Arzneimitteleliminationskurven in allen drei Versuchsgruppen angesehen. Zweitens bestimmten wir die pharmakokinetischen Parameter wie Spitzenzeit, Spitzenkonzentration und Halbwertszeit aller Arzneimittel (siehe Ergänzungstabelle S4) und verglichen die AUC der Kontroll- und Versuchsgruppe. Drittens und viertens untersuchten wir den Einfluss des Steatose-Schweregrads und des Steatose-Musters auf die AUC, indem wir die lineare Korrelation berechneten.

Die pharmakokinetische Analyse ergab erwartungsgemäß für alle drei Verbindungen eine ähnliche exponentielle Eliminationskurve. Die maximale Konzentration trat innerhalb von 15–60 Minuten auf und die Eliminierung des Arzneimittels erfolgte innerhalb von 4–6 Stunden, siehe Abb. 6, für Metaboliten siehe ergänzende Abb. S4. Der schattierte Bereich veranschaulicht das 95 %-Glaubwürdigkeitsintervall der Bayes'schen Analyse. Nicht überlappende Glaubwürdigkeitsintervalle weisen auf einen signifikanten Unterschied in der Dynamik zu diesem bestimmten Zeitpunkt hin. Es ist jedoch schwierig, ein insgesamt anderes Verhalten vorherzusagen, wenn sich die Glaubwürdigkeitsintervalle zeitlich teilweise überschneiden.

Arzneimitteleliminationskurven der Testmedikamente und Metaboliten und entsprechende AUC. (A) Midazolam; (B) Koffein; (C) Codein; *Signifikanzniveau < 0,05, **Signifikanzniveau < 0,01, ***Signifikanzniveau < 0,001, ****Signifikanzniveau < 0,0001, die Stichprobengröße jeder Gruppe wird unten in der Leiste angezeigt. Durchgezogene Linien stellen den Mittelwert dar, schattierte Bereiche entsprechen dem 95 %-Glaubwürdigkeitsintervall der Bayes'schen Analyse.

Die Fütterungsdauer hatte einen Einfluss auf die AUC aller drei Testmedikamente. Wir haben die pharmakokinetischen Parameter berechnet und auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen überprüft. Um schlüssige Aussagen über signifikante Gesamtunterschiede zwischen den Erkrankungen zu treffen, haben wir die AUC-Werte als aggregiertes Maß für die Zeitverläufe untersucht. Dieser Parameter umfasst die Zeit bis zur Spitzenkonzentration, die Spitzenkonzentration (Cmax) und die Halbwertszeit und schien daher für eine eingehende Analyse am besten geeignet.

Zweiwöchige Fütterung, die zu einer vorwiegend mikrovesikulären Steatose führte, beschleunigte die Ausscheidung von Koffein, was durch die geringere AUC angezeigt wurde. Interessanterweise schienen die Tiere gegenüber diesem Effekt irgendwie „tolerant“ zu werden, da die AUC bei den Tieren, die dieser Diät vier Wochen lang ausgesetzt waren, normale Werte erreichte. Im Gegensatz dazu verlangsamte eine vierwöchige Fütterung, die zu einer vorwiegend makrovesikulären Steatose führte, die Ausscheidung von Midazolam und Codein, was durch die größere AUC angezeigt wurde.

Der Schweregrad der Steatose korrelierte mit der AUC von Midazolam und Codein. Als nächstes analysierten wir die Korrelationen zwischen dem Schweregrad der Steatose einzelner Tiere unabhängig von der Fütterungszeit und der entsprechenden AUC, siehe Abb. 7 für die Ausgangsmedikamente und Abb. 7 für die Ausgangsmedikamente. S5, S6 und S7 im Supplement für die Metaboliten. Der Schweregrad der Steatose zeigte eine mäßig positive Korrelation mit der AUC von Midazolam und Codein, was auf eine verlangsamte Elimination beider Testmedikamente hindeutet, siehe auch Abb. 7, Reihe A und Reihe C. Wie erwartet, basierend auf den Ergebnissen der Gruppenanalyse, Wir konnten keinen Zusammenhang zwischen dem Schweregrad der vorübergehend auftretenden mikrovesikulären Steatose und der AUC aller drei Testmedikamente feststellen, siehe Abb. 7, Zeile B.

Korrelation zwischen dem Schweregrad der Steatose und der AUC (AC). (Reihe A) Schweregrad der Steatose, bestimmt durch Lipidtröpfchenanalyse in Prozent der Oberfläche; (Reihe B) Ausmaß der mikrovesikulären Steatose, in Prozent der Oberfläche; (Zeile C) Ausmaß der makrovesikulären Steatose, ausgedrückt in Prozent. (Spalte 1) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der AUC von Midazolam; (Spalte 2) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der AUC von Koffein; (Spalte 3) Korrelation von Steatosetyp und -schwere mit der AUC von Codein. Kontrolle als magentafarbene Kreise, zweiwöchige HF-Diät als blaue Quadrate, vierwöchige HF-Diät als grüne Dreiecke.

Das Steatosemuster korrelierte auch mit der AUC von Midazolam und Codein. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Korrelation der Steatosemuster mit der AUC erhalten. Das makrovesikuläre Steatosemuster zeigte eine mäßig positive Korrelation mit der AUC von Midazolam und Codein, was auf eine verlangsamte Elimination von Midazolam und Codein schließen lässt, siehe Abb. 7, Reihe A und Reihe C.

Um einen prägnanten Überblick über die wichtigsten Ergebnisse und beobachteten Zusammenhänge zu geben, haben wir eine systematische Korrelationsanalyse durchgeführt, siehe Abb. 8.

Korrelationsanalyse. Korrelationsmatrix basierend auf der Pearson-Korrelation mit positiver Korrelation in Blau und negativer Korrelation in Rot. Die Flächen des Kreises sind proportional zum Korrelationskoeffizienten. Die Signifikanzniveaus sind *0,05, **0,01 und ***0,001, wobei die p-Werte für mehrere Tests mit Benjamini und Hochberg angepasst wurden. Die Funktionen wurden nach Kategorien sortiert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass (a) alle der Steatose entsprechenden Variablen eine hochsignifikante positive Korrelation zueinander zeigten (Lipidtröpfchen, mikrovesikuläre Steatose, makrovesikuläre Steatose, Triglyceridgehalt). (b) Es konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen Steatosevariablen und der Verteilung der CYP-Expression beobachtet werden, wie durch die mit CYP3A4 und CYP1A2 bedeckte Oberfläche angezeigt, wohingegen im Fall von CYP2E1 eine kleine positive Korrelation bestand. (c) Der Proteingehalt zeigte einen starken negativen Zusammenhang mit den Steatoseparametern. (d) Die über EROD (CYP1A) und EMND (CYP3A) gemessene CYP-Aktivität zeigte einen negativen Zusammenhang mit den Steatoseparametern, wohingegen PNHP (CYP2E1) einen stark positiven Zusammenhang zeigte. (e) Lipidtröpfchen und Makrosteatose korrelierten positiv mit der AUC von Midazolam und Codein.

Unsere Studie führte zu vier neuen Erkenntnissen. (1) Die diätetische Induktion mit einer fettreichen Diät mit niedrigem Methioningehalt führte zu einer gemischten periportalen Steatose, die heterogen in der gesamten Leber verteilt war. (2) Schweregrad und Muster der periportalen Steatose waren nicht mit Veränderungen in der Zonenverteilung und dem Ausmaß der CYP-Expression verbunden. (3) Schweregrad und Muster der periportalen Steatose waren mit Veränderungen der Ex-vivo-Aktivität von CYP1A, CYP3A und CYP2E1 verbunden. (4) Schweregrad und Muster der periportalen Steatose waren mit Veränderungen in der Pharmakokinetik von Koffein (CYP1A2) und Midazolam (CYP3A4) verbunden, nicht jedoch von Codein (CYP2D6).

Wir waren daran interessiert, den Einfluss einer klar definierten zonierten Verteilung der Steatose auf perizentrale Prozesse zu untersuchen. Daher haben wir ein Ernährungsmodell der periportalen Steatose ausgewählt, um die Auswirkung auf den Arzneimittelstoffwechsel zu untersuchen, einen der Schlüsselprozesse, die in der perizentralen Zone ablaufen.

Wir verwendeten eine fettreiche Diät mit reduziertem Methionin und Cholin, um eine periportale Lebersteatose zu induzieren. Unter Verwendung dieser Diät entwickelte sich bei Ratten innerhalb einer Woche nach der Fütterung eine periportale Steatose26. Innerhalb von zwei Wochen nach der Fütterung wurde eine Ausbreitung auf die Mittelzonenregion beobachtet. Innerhalb von vier Wochen nach der Fütterung kam es zu einer schweren Steatose, die sich von der periportalen bis zur perizentralen Region erstreckte. Im Gegensatz dazu reagierten Mäuse langsamer auf dieses Induktionsprotokoll, wie aufgrund einer aktuellen Überprüfung von Zhong27 erwartet wurde. Er kam zu dem Schluss, dass Ratten anfälliger für eine fettreiche Ernährung waren als Mäuse, was durch ein schnelleres Fortschreiten der histologischen Veränderungen angezeigt wurde. der histologischen Veränderungen.

Darüber hinaus zeigten Mäuse im Vergleich zu Ratten ein etwas anderes Steatosemuster. Mäuse zeigten nicht nur eine makrovesikuläre Steatose, sondern auch eine mikrovesikuläre Steatose. Dieses mikrovesikuläre Muster war nach zweiwöchiger Fütterung stärker ausgeprägt als nach vierwöchiger Fütterung. Dieser Befund steht im Einklang mit der Vorstellung, dass sich Steatose aus der Ansammlung kleiner Lipidtröpfchen (mikrovesikuläre Steatose) in einigen wenigen Hepatozyten zu entwickeln scheint25,28. Irgendwann verschmelzen die Mikrovesikel zu einer großen Vakuole, die dem fettbeladenen Hepatozyten das typische Siegelring-Aussehen verleiht. Daher gilt die makrovesikuläre Steatose als Folge eines eher chronischen Prozesses.

Es gibt jedoch auch andere Gründe für eine mikrovesikuläre Steatose. Eine mikrovesikuläre Steatose kann als Folge einer akuten oder toxischen Schädigung der Leber auftreten29. Es wird auch im Zusammenhang mit einer medikamenteninduzierten Leberschädigung beobachtet30. Laut Silva kann sich eine mikrovesikuläre Steatose aufgrund einer Beeinträchtigung der mitochondrialen Beta-Oxidation von Fettsäuren entwickeln, was auf eine mitochondriale Störung31 schließen lässt, die möglicherweise die Stoffwechselfunktion beeinträchtigt.

Die Einstufung des Schweregrads der Lebersteatose erfolgte nach vier komplementären Ansätzen. Die biochemische Quantifizierung von TG und die Quantifizierung der relativen Oberfläche fettbeladener Hepatozyten unterschieden klar zwischen normalen und steatotischen Lebern. Die Unterscheidung zwischen den beiden Steatose-Induktionsprotokollen wurde durch die Lipidtröpfchenanalyse ermöglicht. Die Analyse von Lipidtröpfchen wird häufig verwendet24,32,33,34 und basiert auf der Identifizierung der weißen Fläche der Lipidtröpfchen im Vergleich zur übrigen Fläche. Allerdings ist die Genauigkeit bei mikrovesikulärer Steatose beeinträchtigt, da die kleinen Tröpfchen nicht eindeutig identifiziert werden können. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, den Mustererkennungsalgorithmus zur Quantifizierung der Mikro- bzw. Makrosteatose separat zu trainieren, ein vergleichbarer Ansatz22,35, aber präziser als die klinische Routinediagnose. Die pathologische Beurteilung des Schweregrads basiert auf der Schätzung des relativen Prozentsatzes der Hepatozyten mit einem Lipidtröpfchen22,36. Allerdings müssen Pathologen auch die zonale Verteilung (periportale versus perizentrale Steatose) und das Steatosemuster (makrovesikuläre versus mikrovesikuläre Steatose) angeben, allerdings nur qualitativ.

Unsere Studie brachte drei neue Beobachtungen zutage, die den Einfluss der periportalen Steatose auf den Arzneimittelstoffwechsel verdeutlichen und weitere Aufmerksamkeit verdienen. Wie oben dargelegt, hatte die periportale Steatose keinen Einfluss auf das perizentrale Expressionsmuster der vier untersuchten CYP-Schlüsselenzyme. Allerdings beeinflusste die periportale Steatose die Aktivität von CYP1A, CYP2E1 und CYP3A. Periportale Steatose beeinflusste auch die Pharmakokinetik von Koffein (CYP1A2) und Midazolam (CYP3A4), nicht jedoch von Codein (CYP2D6).

Der Einfluss des Steatosemusters oder der Zonenverteilung auf das Ausmaß und die Verteilung der CYP-Expression ist nicht ausreichend untersucht. Keine der veröffentlichten Studien zum Arzneimittelstoffwechsel offenbarte diese Merkmale (Ergänzungsmaterialien, Tabellen S1 und S2) bei der Beschreibung ihrer Ergebnisse. Interessanterweise beobachteten wir keinerlei Auswirkungen der Steatose auf die Verteilung der CYP-Proteinexpression, unabhängig von Schweregrad oder Muster. Andere Studien berichteten über ein verringertes Expressionsniveau in steatotischen Lebern von menschlichen Patienten17, Ratten12,37 und Mäusen38, wie durch Western Blot oder qPCR nachgewiesen wurde (Ergänzungsmaterialien, Tabelle S3). Allerdings untersuchten sie das Ausmaß der zonalen Verteilung nicht mittels Immunhistochemie. Es ist möglich, dass die Zonierung unbeeinflusst bleibt, aber die Gesamt-mRNA- und Proteinexpressionsniveaus können in einer stark steatotischen Leber verringert sein. Um dieses Problem zu klären, sind ergänzende Techniken erforderlich. Die räumliche Verteilung muss mittels Immunhistochemie visualisiert und quantifiziert werden, die Protein- bzw. mRNA-Expression muss mittels Western Blot oder qPCR quantifiziert werden.

Dennoch spiegeln Änderungen der mRNA-Spiegel nicht unbedingt Änderungen der Proteinkonzentrationen wider und können aufgrund posttranskriptioneller, translationaler und posttranslationaler Regulierungsprozesse möglicherweise keine Vorhersage der Proteinaktivität treffen39.

Betrachtet man den Mechanismus, der den regulatorischen Prozessen der CYP-Expression zugrunde liegt, erhöht die Berücksichtigung von Verteilung und Aktivität die Komplexität zusätzlich. Beispielsweise wird die Hochregulierung von CYP2E1 bei Fettlebererkrankungen auf unterschiedliche Mechanismen zurückgeführt, wie in einer aktuellen Übersicht von Massart et al.40 zusammengefasst. Bei alkoholbedingten Lebererkrankungen wird angenommen, dass die höheren CYP2E1-Spiegel auf die Hemmung des Abbaus durch Ethanol zurückzuführen sind. Der Mechanismus bei der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung ist weniger klar. Es wurde ein Teufelskreis postuliert, der mit einem erhöhten Fettsäurespiegel und einer Insulinresistenz begann, die die Expression von CYP2E1 förderte. Die im Gegenzug erhöhten CYP2E1-Spiegel können zu Lipidperoxidation und oxidativen Schäden führen und die Insulinresistenz verschlimmern, was die Fettansammlung in der Leber verstärkt.

Allerdings wurden in den Studien, die einen Einfluss der Steatose auf die CYP-Expressionsniveaus berichteten, andere Tiermodelle der Steatose verwendet, ein Faktor, der sich ebenfalls auf die Vergleichbarkeit der Ergebnisse auswirkte. Stärkel et al. beobachteten bei mit MCD gefütterten Ratten eine Abnahme der CYP2E1-Expression und -Aktivität12. Im Gegensatz dazu haben Zhang et al. verwendeten das HF-Diätmodell und beobachteten eine verringerte Aktivität und mRNA-Expression der Phase-I-Enzyme CYP1A2, CYP2B1, CYP2C11, CYP3A1 und CYP4A1. Interessanterweise beobachtete er keinen Einfluss auf die CYP2E1-Expression in der Leber fettleibiger Ratten37 (Ergänzungsmaterial, Tabelle S3).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regulierung der CYP-Expressionsniveaus, -Verteilung und -Aktivität bei Steatose recht komplex zu sein scheint, da sie möglicherweise mit der Ätiologie bzw. dem verwendeten Tiermodell zusammenhängt.

Dennoch gibt es bestimmte Lebererkrankungen, bei denen die Zonierung und Färbungsintensität des CYP-Proteins durch die zugrunde liegende Lebererkrankung beeinflusst wird. Dies ist offensichtlich dann der Fall, wenn die Vitalität perizentraler Hepatozyten beeinträchtigt ist, wie es häufig nach einer Intoxikation der Fall ist. Eine CCl4-induzierte toxische Leberschädigung mit perizentraler Nekrose führte zu einer Abnahme der Expression und Färbungsintensität von CYP-Proteinen19. Allerdings kann es auch bei einer periportalen morphologischen Beeinträchtigung zu einer Veränderung der CYP-Expression kommen. Das beste Beispiel ist die Studie von Ghallab, der einen Verlust der CYP-Expression nicht nur bei perizentraler, sondern auch bei periportaler Fibrose beobachtete8. Morphologische Schäden sind jedoch nicht unbedingt Voraussetzung für eine veränderte CYP-Expression. Trotz normaler Morphologie wurde in einem Mausmodell mit chronischer intermittierender Hypoxie, die Schlafapnoe nachahmt, ein selektiver Verlust der CYP1A-mRNA- und -Proteinexpression beobachtet41.

Diese Beobachtungen legen nahe, dass zelluläre oder molekulare Ereignisse in der periportalen Region zu einer molekularen Reaktion von Zellen in den perizentralen Regionen führen könnten. Wie bereits dargelegt, postulierte Ghallab, dass Entzündungsmediatoren im Fall der periportalen Fibrose die zelluläre Reaktion perizentraler Hepatozyten hervorrufen könnten, ähnlich wie im Fall der perizentralen Fibrose beobachtet8.

Periportale Steatose hatte einen Einfluss auf die Aktivität ausgewählter CYP-Enzyme, obwohl das Expressionsmuster unverändert blieb. Hier beobachteten wir, dass die Aktivität der CYP1A- und CYP3A-Familie im Lebergewebe mit zunehmendem Schweregrad herunterreguliert wurde, während die Aktivität von CYP2E1 hochreguliert wurde. Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen anderer Gruppen überein, die in einer aktuellen Übersicht von Cobbina18 zusammengefasst wurden, und werden durch unsere vorgestellte Literaturaufarbeitung weiter bestätigt (Ergänzungsmaterial, Tabelle S3). Diese Studien konzentrierten sich jedoch auf die Auswirkungen der Steatose selbst, untersuchten jedoch nicht unterschiedliche Schweregrade, Muster oder zonierte Verteilung.

Die Aktivität von Enzymen aus der CYP3A-Familie war bei Steatose sogar speziesübergreifend herunterreguliert: beim Menschen mit NASH17,42,43 sowie bei Mäusen, die HFD ausgesetzt waren42, und Ratten44. In ähnlicher Weise beobachteten auch andere, dass die Aktivität von Enzymen aus der CYP1A-Familie herunterreguliert war, wiederum bei Menschen17 und Ratten37, jedoch noch nicht bei Mäusen.

Nur wenige Studien untersuchten die Steatose-bedingte Modulation der CYP2E1-Aktivität. Die meisten Studien, die sich auf CYP2E1 konzentrierten, untersuchten die mRNA- oder Proteinexpression. Interessanterweise scheint die CYP2E1-Aktivität mit der Ernährung zusammenzuhängen. Stärkel verglich zwei verschiedene Ernährungsmodelle und beobachtete eine erhöhte Aktivität bei der Anwendung von 5 % Orotsäure, jedoch eine verringerte Aktivität bei der Fütterung der Tiere mit einer MCD-Diät über 2–6 Wochen12. Im letzteren Fall schien die damit einhergehende ausgeprägte Entzündung einen negativen Einfluss auf die Aktivität zu haben.

In unserer Analyse korrelierten wir das Ausmaß der mikro- bzw. makrovesikulären Steatose mit der CYP-Aktivität und beobachteten auffällige Unterschiede zwischen den beiden Mustern hinsichtlich der Aktivität von CYP2E1. Mikrovesikuläre Steatose hatte keinen Einfluss auf die CYP2E1-Aktivität. Im Gegensatz dazu korrelierte die überwiegend makrovesikuläre Steatose positiv mit der CYP2E1-Aktivität. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem von Stärkel, der eine Herunterregulierung von CYP2E1 nach Auslösung einer makrovesikulären Steatose bei Ratten beschrieb, die der MCD-Diät unterzogen wurden12. Basierend auf diesen Beobachtungen muss die Rolle der Ätiologie, des Steatosemusters oder der begleitenden Entzündung weiter definiert werden.

Diese Überlegungen werden jedoch durch die Schwierigkeit eingeschränkt, Enzymaktivitäten zu unterscheiden und zu bewerten, die der Expression jeder Isoform entsprechen. Dennoch sollte die zonale Verteilung der Expression jeder Isoform bei Mäusen genau verfolgt werden, um den Zusammenhang mit dem Schweregrad der Steatose zu klären. Über eine mögliche Kreuzreaktivität der verwendeten Isoform-Antikörper ist wenig bekannt.

Im Gegensatz dazu misst einer der fünf Aktivitätstests hauptsächlich die Aktivität einer Isoform, wie in der geänderten Tabelle 3 gezeigt. Der PNPH-Test bewertet hauptsächlich die Aktivität einer einzigartigen Isoform, der CYP 2E1. Der EROD-Assay bewertet die Aktivität der Unterfamilie 1A mit ihrer Hauptisoform 1A2. Der PROD-Assay dient zur Beurteilung der Aktivität der CYP2B-Familie mit den Schlüsselisoformen 2B6 und 2B1. Im Gegensatz dazu ist der EMND-Assay breiter und deckt die Unterfamilie CYP3A mit ihren Hauptisoformen 3A4, 3A1 und 3A2 sowie weitere Isoenzyme wie Cyp3a11, 3a13 und 3a1645 ab. Der ECOD-Assay ist auch ziemlich breit angelegt, indem er die kombinierte Aktivität der Isoformen 1A1, 1A2, 2A1, 2A6, 2B1, 2B6, 2C9 und 2C11 misst.

Darüber hinaus wird das typischerweise verwendete Testmedikament Midazolam auch durch andere CYP-Isoenzyme anderer Unterfamilien metabolisiert46.

Daher ist es in der Tat schwierig, die Enzymaktivitäten eindeutig der Expression jeder Isoform zuzuordnen und sie mit dem Schweregrad der Steatose in Zusammenhang zu bringen.

Wir können jedoch für CYP2E1 klarstellen, dass das Expressionsmuster nicht durch Steatose beeinflusst wurde, wohingegen die Aktivität positiv mit dem Schweregrad der Steatose korrelierte und beim Vergleich stark steatotischer Proben mit Kontrollproben eine hohe Signifikanz erreichte (p < 0,001). Ebenso können wir feststellen, dass das Expressionsmuster von CYP1A2 in allen drei Gruppen ähnlich war, wohingegen die Aktivität negativ mit dem Schweregrad der Steatose korrelierte und beim Vergleich von stark steatotischen Proben mit Kontrollproben eine mäßige Signifikanz erreichte. Allerdings untersuchten wir nicht die zonalen Proteinexpressionsniveaus jeder Isoform in der Mausleber, wie dies in einer technisch sehr anspruchsvollen Studie von Tachikawa et al.47 der Fall war.

Wir untersuchten auch den Einfluss von Schweregrad und Muster der Steatose auf die Pharmakokinetik von drei Testmedikamenten. Wir beobachteten unterschiedliche Wirkungen jedes Arzneimittels. Ein Vergleich unserer Ergebnisse mit anderen Studien ist schwierig, da die meisten von ihnen die Steatose nicht detailliert charakterisieren. Dennoch wurde in früheren Studien38,42,48,49,50 der Einfluss von Steatose auf den Arzneimittelstoffwechsel kontrovers diskutiert. Dies deutet darauf hin, dass neben dem Vorhandensein oder Fehlen einer Steatose eine Vielzahl weiterer Faktoren den Arzneimittelstoffwechsel beeinflussen können.

Vorwiegend mikrovesikuläre Steatose schien die Pharmakokinetik von Koffein zu beschleunigen, was durch die geringere AUC angezeigt wird. Dieser Effekt war jedoch vorübergehend. Sobald die Tiere eine überwiegend makrovesikuläre Steatose entwickelten, verlangsamte sich die Ausscheidung wieder auf den Normalwert, was durch die statistisch signifikant größere AUC angezeigt wurde. Im Gegensatz dazu berichtete Li unter Verwendung eines Modells mit einer noch schwerwiegenderen makrovesikulären Steatose bei ob/ob-Mäusen, die mit einer MCD-Diät gefüttert wurden, über eine signifikant höhere AUC für Koffein im Vergleich zur Kontrolle38. Basierend auf diesen Beobachtungen scheint der Koffeinstoffwechsel, der die Aktivität von CYP1A2 widerspiegelt, stark durch das Muster der Steatose mit gegensätzlichen Auswirkungen beeinflusst zu werden.

Im Gegensatz dazu wurde die PK von Midazolam und Codein durch mikrovesikuläre Steatose nicht beeinflusst. Bei überwiegend makrovesikulärer Steatose war die Elimination von Midazolam jedoch verlangsamt, was durch die deutlich größere AUC im Vergleich zur Gruppe mit mikrovesikulärer Steatose angezeigt wird. Unter Verwendung eines anderen Protokolls zur Induktion der Steatose beobachteten Li und Mitarbeiter keinen Einfluss der Steatose auf die Elimination von Midazolam38. Im Gegensatz dazu berichteten Woolsey und Mitarbeiter, dass eine beim Menschen induzierte nichtalkoholische Steatohepatitis zu einem Anstieg der AUC von Midazolam und einer verzögerten Eliminationsrate führte42. Sie machten jedoch keine Angaben zur Zonierung und zum Verteilungsmuster der Steatose. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht nur die Art und das Muster eine Rolle spielen könnten, sondern auch die Ätiologie der Steatose.

In unserer Studie zeigte die periportale Steatose keinen Einfluss auf die Eliminationsrate von intraperitoneal injiziertem Codein, das auf CYP2D6 hinweist. In einem Rattenmodell, das mit einer 1 % Orotsäure enthaltenden Diät gefüttert wurde, hatte eine schwere Steatose einen signifikanten Einfluss auf die AUC und die Eliminationsrate von oral verabreichtem Metoprolol (Wirkstoffsubstrat von CYP2D6). Dieser Effekt war jedoch nicht erkennbar, wenn Metoprolol intravenös injiziert wurde50. Diese Beobachtung legt nahe, dass auch der Verabreichungsweg einen Unterschied machen könnte. In unserer statistischen Analyse beobachteten wir einerseits eine moderate Korrelation zwischen der Schwere bzw. dem Ausmaß der makrovesikulären Steatose und der AUC von Midazolam und Codein. Im Gegensatz dazu konnten wir keinen Zusammenhang zwischen dem Schweregrad bzw. Muster der Steatose und der AUC von Koffein beobachten. Darüber hinaus zeigte die mikrovesikuläre Steatose keine Korrelation mit der AUC eines der drei Testmedikamente. Diese Ergebnisse belegen, dass Schweregrad und Muster relevante Faktoren sind, die ausgewählte Parameter des Arzneimittelstoffwechselsystems beeinflussen.

Unsere Ergebnisse deuten auf eine viel höhere Komplexität hinsichtlich der Wechselbeziehung zwischen Steatose und Arzneimittelstoffwechsel hin. Nach unserem besten Wissen ist diese Studie der erste Bericht, der feststellt, dass der Arzneimittelstoffwechsel nicht nur durch das Vorhandensein einer Steatose beeinflusst wird, sondern auch mit der Schwere und dem Muster der Fettansammlung zusammenhängt. Obwohl die Steatose das Verteilungsmuster nicht beeinflusste, korrelierte der Schweregrad der periportalen makrovesikulären Steatose mit der Aktivität perizentraler exprimierter CYP-Enzyme und der entsprechenden Arzneimittelelimination, dargestellt durch die AUC.

Infolgedessen könnte die Regulierung der Aktivität perizentraler CYP-Enzyme durch Faktoren beeinflusst werden, die über das Vorhandensein oder Fehlen von Fett in den perizentralen Hepatozyten hinausgehen, was auf einen von Ghallab postulierten Signalmechanismus im Fall periportaler Fibrose schließen lässt8.

Wie bereits erwähnt, ähnelt dieser Befund dem jüngsten Befund von Ghallab und Mitarbeitern, der in der Einleitung8 erwähnt wurde, dass periportale Fibrose die metabolische Zonierung ähnlich wie perizentrale Fibrose beeinflusste. Sie schlugen in einer anderen Veröffentlichung51 eine entzündungsbedingte Unterdrückung metabolischer Gennetzwerke bei akuten und chronischen Lebererkrankungen vor. Darüber hinaus beobachteten sie, dass verschiedene Arten von akuten und chronischen Entzündungsreizen dieselben Genregulationsnetzwerke aktivierten. Die Hochregulierung von Entzündungsgenen erfolgte gleichzeitig mit der Herunterregulierung von Stoffwechselgenen. Dies nannten Ramadori und Christ „Molekulare Ökonomie der hepatischen Akute-Phase-Reaktion“52. Die Annahme, dass selbst eine Lebersteatose ohne ausgeprägte Steatohepatitis einen leichten Entzündungsreiz darstellen würde, könnte unsere Beobachtung einer periportalen Steatose erklären, die die Aktivität bestimmter CYP-Enzyme beeinflusst. Allerdings könnte die Tatsache, dass der Arzneimittelstoffwechsel auch ohne morphologische Veränderungen verändert sein kann, wie sie im Mausmodell der chronischen intermittierenden Hypoxie beobachtet wurden, für andere Signalmechanismen sprechen41.

Diese Beobachtungen erfordern weitere und umfassendere Untersuchungen des Arzneimittelstoffwechsels und eventueller intralobulärer Signalmechanismen. In zukünftigen Studien sollte die Beurteilung des Arzneimittelstoffwechsels alle Aspekte einschließlich der CYP-Enzymverteilung, des Expressionsniveaus, der Aktivität und der Pharmakokinetik umfassen. Im Hinblick auf eine Steatose sollten nicht nur Ätiologie, Schweregrad, Art und zonale Verteilung der Fettansammlung berücksichtigt werden, sondern auch Entzündungsmediatoren oder andere Signalmoleküle. Dies könnte helfen, die derzeit beobachteten kontroversen Ergebnisse besser zu verstehen.

Männliche C57BL6/J-Mäuse wurden entweder zwei oder vier Wochen lang mit einer fettreichen Diät mit niedrigem Methionin- und Cholingehalt (HF-Diät) gefüttert. Im Gegensatz zur Methionin-Cholin-Mangeldiät (MCD) induziert dieses Ernährungsprotokoll Periportal Steatose bei Ratten und Mäusen, verursacht aber keinen Gewichtsverlust23,24,26,35. Die Kontrollgruppe erhielt eine Standard-Erhaltungsdiät, was zu drei Versuchsgruppen führte (n = 4–6/Gruppe).

Die Lebersteatose wurde histologisch im Hinblick auf das Muster (mikro- versus makrovesikulär), die zonierte Verteilung (periportal versus perizentral) und den Schweregrad charakterisiert. Der Schweregrad der Steatose wurde anhand eines Triglyceridtests und einer automatisierten computergestützten quantitativen Bewertung anhand ganzer Objektträgerscans beurteilt.

Die räumliche Verteilung von vier Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen (CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4) wurde durch Immunhistochemie sichtbar gemacht. Die CYP-Aktivität wurde anhand von fünf Modellreaktionen in einem photometrischen oder fluorometrischen Assay bestimmt. Die Pharmakokinetik wurde mithilfe eines Medikamentencocktails bestehend aus Koffein, Midazolam und Codein beurteilt. Auf die Injektion des Medikamentencocktails folgte eine Mikroblutentnahme zu zehn festgelegten Zeitpunkten über einen Zeitraum von sechs Stunden und eine anschließende Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse (UPLC-MS/MS) im Tierversuch.

Alle In-vivo-Studien wurden mit männlichen C57BL6/J-Mäusen (Janvier, Frankreich) mit einem Körpergewicht von 28–30 g im Alter zwischen acht und zehn Monaten (ehemaliger Züchter) (n = 4–6/Gruppe) durchgeführt. Mäuse wurden zufällig in Gruppen von drei Tieren untergebracht und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Käfige wurden unter konstanten Umgebungsbedingungen mit einem zwölfstündigen Hell-Dunkel-Zyklus in einer herkömmlichen Tierhaltung, konstanter Raumtemperatur (21 ± 2 °C) und 45–65 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten.

Mäuse wurden entweder 2 Wochen oder 4 Wochen lang mit der gleichen HF-Diät (E15652-94 EF R/M, fettreicher MCD-Mod, Ssniff Spezialdiäten GmbH, Sulzfeld, Deutschland) gefüttert, um Steatose unterschiedlichen Schweregrades zu induzieren (Einzelheiten finden Sie im Zusammensetzung siehe Ergänzungstabelle S5). Die Kontrollgruppe der Mäuse wurde mit der Standard-Erhaltungsdiät (Altromin Spezialfutter GmbH, Deutschland) versorgt. Körpergewichtszunahme und Nahrungsaufnahme wurden täglich überwacht.

Der Wirkstoffcocktail bestand aus Koffein, Midazolam und Codein (2 mg/kg Körpergewicht (KG), 5 mg/kg KG bzw. 2 mg/kg KG) und wird häufig für pharmakokinetische Studien19 verwendet, siehe Tabelle 1. Jeweils Das Arzneimittel wurde in 200 µl sterilem Wasser verdünnt, was eine Konzentration von 1 mg/ml für Midazolam und Codein und 2,5 mg/ml für Koffein ergab. Die drei Aliquots wurden gemischt, was ein Gesamtvolumen von 600 µl ergab. Das aufzutragende Volumen (180 µl/30 g Körpergewicht) wurde anhand des Körpergewichts der einzelnen Maus berechnet.

Der Medikamentencocktail wurde per intraperitonealer Injektion verabreicht. Aus drei Gründen bevorzugten wir diese Methode im Vergleich zur oralen oder intravenösen Injektion: erstens, um den durch die Sondenernährung verursachten Stress für das Tier zu reduzieren; zweitens, um das Risiko von Komplikationen nach einer intravenösen Injektion in die Penisvene zu verringern; Drittens soll das Risiko einer Arzneimittelkontamination bei der Injektion und Probenentnahme an derselben Stelle, der Schwanzvene, verringert werden, was möglicherweise zu falsch positiven Ergebnissen führt53.

Den Tieren wurden zu zehn festgelegten Zeitpunkten über einen Zeitraum von sechs Stunden (vor der Injektion, 15 Min., 30 Min., 1 Std. (h), 1,5 Std., 2 Std., 2,5 Std., 3 Std., 4 Std., 6 Std.) wiederholt Mikroblutproben entnommen ). Die Proben wurden aus der Schwanzvene mit heparinisierten, kalibrierten End-to-End-Kapillarröhrchen (Minicaps, Hirschmann) mit einem Volumen von 9 μl (Genauigkeit 0,5 %, CV < 1 %) entnommen. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der Injektion des Medikamentencocktails mit einer Überdosis Isofluran und Ausbluten getötet.

Lebergewebeproben wurden aus vier verschiedenen Leberlappen (linker Seitenlappen, rechter Mittellappen, rechter Oberlappen und unterer Schwanzlappen) entnommen und entweder einer Formalinfixierung und Paraffineinbettung unterzogen oder bei -80 ° eingefroren und kryokonserviert Bis zum Gebrauch bei C aufbewahren.

Tierversuche wurden gemäß den aktuellen deutschen Tierschutzvorschriften und -richtlinien sowie den ARRIVE-Richtlinien zur Meldung von Tierversuchen durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland genehmigt (Genehmigungsnummer: UKJ-19-020).

Mit Formalin fixierte Proben wurden in Paraffin eingebettet. Zur Herstellung von 3-µm-Schnitten wurden Blöcke verwendet. Zur Beurteilung der Steatose wurden die Schnitte einer HE-Färbung unterzogen. Andere Schnitte wurden für die Immunhistochemie verwendet, um die räumliche Verteilung von vier verschiedenen CYP-Enzymen zu bestimmen. Gefärbte Schnitte wurden mit einem Vollbildscanner (L11600, Hamamatsu, Japan), der mit der Bildbetrachtungssoftware NDP.view2Plus (Version U12388-02) ausgestattet war, bei 40-facher Vergrößerung digitalisiert.

Die Steatose wurde qualitativ hinsichtlich Art und Verteilung in ganzen Objektträgerbildern aus HE-Schnitten beurteilt. Wir unterschieden zwischen mikro- und makrovesikulärer Steatose und dem gemischten Muster anhand der Größe der Lipidtröpfchen in den Hepatozyten. Darüber hinaus unterschieden wir zwischen Zonierungsmustern wie periportaler, mittelzonaler und perizentraler Steatose. Wir untersuchten auch die intrahepatische Verteilung der Steatose, indem wir jeweils einen Abschnitt aus jedem der vier Leberlappen analysierten.

Um den Schweregrad der Steatose zu bestimmen, untersuchten wir Schnitte aus vier verschiedenen Leberlappen desselben Tieres, um die relative Stichprobengröße zu erhöhen. Wir haben den mittleren Schweregrad der Steatose basierend auf der Gesamtoberfläche berechnet, die von den einzelnen Lappen bedeckt ist (relative Oberfläche, die von Lipidtröpfchen bzw. von makro- und mikrovesikulärer Steatose bedeckt ist).

Das Ausmaß bzw. der Schweregrad der Steatose wurde mit Histokat quantifiziert, einer proprietären Software, die auf einem von Fraunhofer MEVIS entwickelten maschinellen Lernalgorithmus basiert. Der Algorithmus unterteilt den gesamten Diascan in kleine quadratische Kacheln einer bestimmten Größe. Mithilfe von mindestens 30 Kacheln pro Bild der vier verschiedenen Leberlappen in einem Abschnitt und verschiedenen repräsentativen Bildern der Serie wurde die Software darauf trainiert, einzelne Ereignisse wie Lipidtröpfchen (Ereigniserkennungsalgorithmus) oder bestimmte Muster (Mustererkennungsalgorithmus) zu erkennen. .

Zunächst haben wir die Anzahl und relative Oberfläche im Bild beurteilt, die von Lipidtröpfchen bedeckt ist, unabhängig von ihrer Größe, siehe Abb. 9B, C. Für eine normale Leber siehe Abb. 9A. Zweitens verwendeten wir den Mustererkennungsalgorithmus (generische Klassifizierung 128), um die relative Oberfläche zu quantifizieren, die von fettbeladenen Hepatozyten bedeckt ist. Zweitens haben wir die relative Oberfläche bestimmt, die von mikrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt ist, und die Fläche, die von makrovesikulären steatotischen Hepatozyten bedeckt ist. Die Addition beider ergab die Gesamtoberfläche, die von steatotischen Hepatozyten bedeckt war, siehe Abb. 9E,F. Für eine normale Leber siehe Abb. 9D.

Bildanalyse des gesamten Objektträgerscans mit Abschnitten aus vier verschiedenen Leberlappen mithilfe des Histokat-Ereigniserkennungs- und Mustererkennungsalgorithmus; (A) Überlagerungsbild einer normalen Leber nach Farbcodierung der Lipidtröpfchen mit Gelb; (B,C) Überlagerungsbild einer steatotischen Leber nach Farbkodierung der Lipidtröpfchen mit Gelb; (D) Überlagerungsbild einer normalen Leber nach Farbcodierung der verschiedenen zu quantifizierenden Muster; (E,F) Überlagerungsbild einer steatotischen Leber nach Farbcodierung der verschiedenen zu quantifizierenden Muster. Quadratische Kacheln, eingeteilt in drei Farbklassen (orange für mikrovesikuläre Steatose, gelb für makrovesikuläre Steatose und rot für nicht-steatotische Hepatozyten, Lumen der Gefäße ausgenommen); (G) Überlagerungsbilder einer normalen Leber nach Farbcodierung der immunhistochemischen Visualisierung der CYP3A4-Expression; (H,I) Überlagerungsbilder einer steatotischen Leber nach Farbkodierung der immunhistochemischen Visualisierung der CYP3A4-Expression. Quadratische Kacheln, klassifiziert in zwei Farbklassen (blau für CYP-negative oder leicht gefärbte Hepatozyten und rot für stark bis mäßig CYP-gefärbte Hepatozyten).

Die Immunhistochemie wurde in 3 µm dicken, formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Lebergewebeschnitten durchgeführt. Für den Nachweis von CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 und GS wurden verschiedene CYP-Antikörper verwendet (siehe Tabelle 2). Lebergewebeschnitte wurden mit absteigendem Ethanolgehalt entparaffiniert und rehydriert. Anschließend wurde die Antigengewinnung mit Trinatriumcitratpuffer (Ph6,1) unter Verwendung eines Dampfgarers für 30 Minuten bei 100 °C durchgeführt, gefolgt von einer Abkühlung für 20 Minuten. Zur Blockierung der endogenen Peroxidase wurde auf den Gewebeschnitt eine Peroxidaseblockierung angewendet. Zur Blockierung des endogenen IgG wurde ein gebrauchsfertiger Proteinblock (ab64226, Abcam, Deutschland) verwendet. Gewebeschnitte wurden mit dem jeweiligen CYP-Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert, siehe Tabelle 2. Bei polyklonalen Kaninchen-Primärantikörpern (CYP3A4, CYP2D6 und CYP2E1) wurden die Signale durch Anwendung des Kaninchen-spezifischen HRP/DAB-IHC-Detektionssystems verstärkt (ab236469, Abcam) für 40 Minuten bei Raumtemperatur. Im Fall monoklonaler Maus-Primärantikörper (CYP1A2 und GS) wurden die Antikörper zunächst mit dem Dako Animal Research Kit Peroxidase für Maus-Primärantikörper (K3954, Dako, Dänemark) biotinyliert. In diesem Fall wurde vor der Anwendung des biotinylierten ersten Antikörpers eine zusätzliche Blockierung mit dem Avidin/Biotin-Blockierungskit (ab64212, Abcam) durchgeführt. Anschließend wurde der Avidin-HRP-Komplex hinzugefügt.

Die Visualisierung der Reaktion erfolgte durch die Anwendung des DAB-Chromogens für (3–5) Minuten ebenfalls bei Raumtemperatur. Die Gegenfärbung wurde mit Dako-Hämatoxylin (CS700, Dako, Dänemark) für 6 Minuten durchgeführt. Ein negativer Reagenz-Kontrollobjektträger wurde in jedem Lauf nach den gleichen Verfahren hinzugefügt, ohne dass der primäre Antikörper aufgetragen wurde.

Zur qualitativen Beurteilung ermittelten wir die zonale Verteilung und unterschieden zwischen periportaler, mittelzonaler und perizentraler Lokalisierung des CYP-Signals. Die Signalintensität wurde als leicht, mittel oder stark klassifiziert.

Zur Quantifizierung des CYP-Signals verwendeten wir dieselben generischen 128-Algorithmen wie für Steatose, um die relative Oberfläche zu bestimmen, die von einem bestimmten CYP-Signal abgedeckt wird, siehe Abb. 9H, I. Für eine normale Leber siehe Abb. 9G.

Die hepatische TG-Konzentration wurde durch eine kolorimetrische Methode unter Verwendung eines quantitativen TG-Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (ab65336 Abcam, Deutschland) gemessen. Lipide wurden aus 100 mg schockgefrorenem Lebergewebe extrahiert, indem Lebergewebeproben in 1 ml 5 %iger Igepal-/bidestillierter Wasserlösung mit einem Mörser homogenisiert wurden. Die Proben wurden in einem Thermomixer 4 Minuten lang langsam auf 95 °C erhitzt. Anschließend wurden die Proben abgekühlt und erneut erhitzt, um alle Triglyceride in der Lösung zu lösen. Nach der Zentrifugation zur Entfernung jeglichen unlöslichen Materials wurden die Überstände 1:10 mit bidestilliertem Wasser verdünnt. Alle Reaktionen wurden in Duplikaten durchgeführt. 50 µl der jeweiligen Proben, Standard und 50 µl Probe zur Hintergrundkontrolle wurden in eine transparente 96-Well-Platte gegeben. Dann wurden 2 µl Lipase und Testpuffer für Standard- und Probenvertiefungen hinzugefügt, während 2 µl TG-Testpuffer zur Probenhintergrundkontrolle hinzugefügt wurden. Anschließend wurden die Reaktionen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubiert. Danach wurde die Triglycerid-Reaktionsmischung in alle Reaktionsvertiefungen gegeben, gefolgt von einer 60-minütigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Die Ausgabe wurde auf einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD570 gemessen.

Zur Bestimmung der CYP-Aktivität wurden die folgenden Modellreaktionen durchgeführt; Ethylmorphin-N-Demethylierung (EMND) weist auf CYP3A-Aktivität hin54, Ethoxycumarin-O-Deethylierung (ECOD) weist auf CYP1A-, 2A-, 2B- und 2C-Aktivität55 hin, Ethoxyresorufin-O-Deethylierung (EROD) weist auf CYP1A-Aktivität56 hin, p-Nitrophenol-Hydroxylierung (PNPH), was auf CYP2E1-Aktivität hinweist57, und Pentoxyresorufin-O-Depentylierung (PROD), was auf CYP2B-Aktivität hinweist56. Die Proben wurden mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) (1:2 w/v) homogenisiert. Die homogenisierten Leberproben wurden anschließend 20 Minuten lang bei 4 °C und 9000 × g zentrifugiert. Die 9000 g-Überstände wurden zur Beurteilung der Aktivitäten von CYPs verwendet. Der Proteingehalt wurde mit einer modifizierten Biuret-Methode bewertet. Die CYPs-Aktivität wurde als Proteingehalt des 9000 g Überstands bezeichnet. Für alle Modellreaktionen enthielt die Reaktionsmischung den 9000 g Überstand, das Substrat, NADPH, MgCl2, Glucose-6-phosphat und Puffer. Die Reaktion wurde mit der Zugabe von NADPH gestartet und die Proben wurden bei 37 °C für 5 Minuten (EROD), 10 Minuten (ECOD, PROD, EMND) bzw. 30 Minuten (PNPH) inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von eiskalter Trichloressigsäure (ECOD, PNPH und EMND) oder Methanol (EROD, PROD) gestoppt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und die Konzentrationen der Hauptmetaboliten im Überstand gemessen. PNPH und EMND wurden photometrisch (Spekol 1100, Carl Zeiss, Jena) durch Messung der Hauptmetaboliten 4-Nitrocatechol bzw. Formaldehyd quantifiziert. Die ECOD-Reaktion wurde fluormetrisch durch Quantifizierung der Konzentration des Hauptmetaboliten 7-Hydroxycumarin beurteilt. Für EROD und PROD wurde die Konzentration des Hauptmetaboliten Resorufin zusätzlich fluorimetrisch bestimmt (RF-1502, Shimadzu, Kyoto, Japan), siehe Tabelle 3.

Die Arzneimittelspiegel in Bezug auf das Ausgangsarzneimittel und seine Metabolitenkonzentration wurden in heparinisiertem Vollblut gemessen, siehe Tabelle 4. Die Analyse wurde mit drei speziellen empfindlichen UPLC-MS/MS-Methoden auf einem Acquity UPLC-System durchgeführt, das an Xevo TQ-XS oder TQ-Xevo angeschlossen war. S-Detektor (Waters, Eschborn, Deutschland). Die 9 µl Kapillaren wurden insgesamt mit einem OMNI Bead Ruptor 24 (Bebensee, Deutschland) unter Verwendung einer Yttrium-beschichteten Keramikkugel zerkleinert und dann mit den entsprechenden deuterierten internen Standards angereichert: ad 12,5 ng/ml Midazolam-d4 und OH-Midazolam-d4 oder 250 ng/ml Koffein-d9 oder Codein-d6, Norcodein-d3, Codein-6-glucuronid-d3, Morphin-3-glucuronid-d3 und Morphin-d6 (ad 5,5 ng/ml Vollblut jeweils). Nach der Proteinfällung und Flüssig/Flüssig-Extraktion wurde der verdünnte Überstand in das UPLC-System injiziert. Für jedes Testarzneimittel wurde eine spezifische chromatographische Methode verwendet. Für Midazolam/OH-Midazolam wurde eine Waters CSH C18 1,7 µm, 2,1 × 150 mm Säule verwendet, die bei 50 °C gehalten wurde. Die Gradiententrennung wurde innerhalb von 6 Minuten durchgeführt. Ein Waters BEH-Phenyl 1,7 µm, 2,1 × 100 mm, gehalten bei 40 °C, wurde für die Koffeingradiententrennung innerhalb von 2,5 Minuten verwendet. Für die Gradiententrennung von Codein und Metaboliten bei 50 °C wurde eine Waters HSS T3 1,8 µm, 2,1 × 150 mm Säule ausgewählt. Die chromatographische Laufzeit betrug 9 Minuten. Das Massenspektrometer wurde im ESI+-Modus betrieben und drei Übergänge wurden im SRM für jeden Analyten und zwei für die internen Standards überwacht. Die Bestimmungsgrenzen für Koffein betrugen 10 ng/ml und für alle anderen Analyten mindestens 1,0 ng/ml. Für jeden Analyten wurde eine Mehrpunkt-Matrixkalibrierung durchgeführt. Alle Analyten sind nach der Norm DIN EN ISO 15189 akkreditiert. Midazolam und OH-Midazolam sowie die Opiate sind zusätzlich für forensische Zwecke nach DIN EN ISO 17025 akkreditiert.

Für jede Wiederholung wurden die Zeitverläufe der Stoffwechselkomponenten nach der Bolusinjektion unter der Annahme parametrisiert, dass auf einen Anstieg bis zu einem maximalen Wendepunkt ein exponentieller Abfall folgt. Zur Anpassung der experimentellen Daten wurde die Funktion \(x\left(t\right)=t\cdot {e}^{B-At}\) mit den Parametern A und B verwendet. Die Python-Toolbox lmfit58 wurde verwendet, um diese Parameter für jedes Replikat separat mittels Minimierung der kleinsten Quadrate zu schätzen. Aus jeder angepassten Kurve werden die Spitzenkonzentration \({x}_{peak}\), die Zeit der Spitzenkonzentration \({t}_{peak}\), die Halbwertszeit \({t}_{1/ 2}\) und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde berechnet, siehe Abb. 10.

Pharmakokinetische Parameter werden aus den exponentiellen Abklingkurven berechnet und an die experimentellen Daten angepasst. Dargestellt sind beispielhafte Daten von Codein-6-Glucuronid-Kontrollreplikat 4 mit angepassten Parametern A = 2,168 und B = 5,397. Extrahierte pharmakokinetische Parameter sind die Spitzenkonzentration \({x}_{peak}\), die Zeit der Spitzenkonzentration \({t}_{peak}\), die Halbwertszeit \({t}_{1/2} \) und Fläche unter der Kurve vom Maximum (AUC).

Die AUC wurde nur für die Abklingphase berechnet, d. h. das Integral wurde vom maximalen Wendepunkt bis t = 6 h der angepassten Kurve mit scipy59 berechnet. Die Peakzeit \({t}_{peak}\) wurde durch Minimierung von \(-x(t)\) mit der entsprechenden Peakkonzentration \({x}_{peak}=x({t}_{ Gipfel})\). Die Halbwertszeit \({t}_{1/2}\) wurde als die Zeit berechnet, die benötigt wird, bis sich die Spitzenkonzentration halbiert. Hierzu wurde die Gleichung \(\frac{{x}_{peak}}{2}-t\cdot {e}^{B-At}=0\) nach \(t\) gelöst, wobei die Hälfte -Lebenszeit ergibt \({t}_{1/2}=t-{t}_{peak}\).

Das Modell \(x\left(t\right)\) wurde als Lösung einer gewöhnlichen Differentialgleichung (ODE) \(\dot{x}=(1-A\cdot t)\cdot {e}^{BA) interpretiert \cdot t}\) und im Format Systems Biology Markup Language (SBML)60,61 implementiert. Über yaml2sbml63 wurde ein PEtab62-Parameterschätzungsproblem erstellt. Zur Parameterschätzung wurde die Maximum-Likelihood-Schätzung verwendet. Unter der Annahme eines unabhängigen additiven normalverteilten Rauschens \(\sigma\) lautet die Wahrscheinlichkeitsfunktion \(L(\theta)\).

Dabei ist N die Anzahl der Wiederholungen zu T verschiedenen Messzeitpunkten, \(x\left({t}_{k},\theta \right)\) die Lösung der ODE und \({m}_{j }\left({t}_{k}\right)\) bezeichnet den Messwert des j-ten Replikats zum Zeitpunkt \({t}_{k}\). Das PEtab-Format kodiert diese Wahrscheinlichkeitsfunktion und wurde für eine Bayes'sche Unsicherheitsquantifizierung verwendet. Für die Parameter A und B wurde eine gleichmäßige Prior-Verteilung im Intervall [0, 100] verwendet. Ebenso wurde der Prior für \(\upsigma\) einheitlich im Intervall [0, 1000] gewählt.

Die Parameter wurden mittels Markov Chain Monte Carlo (MCMC)-Probenahme mit dem pyPESTO-Softwarepaket64 erfasst. Zur Beurteilung der posterioren Verteilung wurde der adaptive Paralleltemperierungs-Probenehmer65 mit vier Ketten und 200.000 Proben verwendet. Um die Konvergenz der MCMC-Ketten zu untersuchen und die Einbrennproben zu zerlegen, wurde der Geweke-Test66 angewendet. Die ersten 100 Samples wurden zumindest gekürzt, auch wenn der Geweke-Test eine geringere Anzahl vorschlug, um sicherzustellen, dass nur Samples aus der konvergenten Kette für das Ensemble verwendet wurden. Die Konvergenz der Ketten wurde visuell und durch die Berechnung der effektiven Stichprobengröße (ESS) überprüft. Der ESS aller Ketten lag bei über 13.900 Proben, die detaillierten Ergebnisse finden Sie auf FAIRDOMHub. Aus der Parameter-Posterior-Verteilung wurde mit pyPESTO ein Parameterensemble erstellt und über AMICI67 simuliert. Diese Vorwärtssimulationen wurden verwendet, um die Glaubwürdigkeitsintervalle der posterioren Vorhersageverteilungen für die Modellausgaben zu berechnen. Das SBML-Modell, die Yaml-Datei, die das Problem der Parameterschätzung beschreibt, die vollständige Stichprobe des Parameters posterior, geschätzte Parameter, AUC-Werte, Halbwertszeiten und eine Visualisierung der Stichprobenspuren finden Sie unter FAIRDOMHub [https://doi.org /10.15490/FAIRDOMHUB.1.STUDY.1070.1].

Eine deskriptive gewöhnliche einfaktorielle ANOVA wurde verwendet, um den Einfluss des diätetischen Induktionsprotokolls auf die TG-Spiegel, den Schweregrad der Steatose (relative Oberfläche, die von Lipidtröpfchen bzw. von makro- und mikrovesikulärer Steatose bedeckt ist), die CYP-Aktivität und die immunhistochemische Expression sowie die abgeleitete AUC zu ermitteln aus der PK-Analyse. Der Mehrfachvergleichstest von Tukey wurde mit GraphPad Prism Version 9.3.1(471) für Windows, GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA, www.graphpad.com durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Unterschiede wurden bei p-Werten unter 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Der Pearson-Korrelationskoeffizient (r) mit einem Konfidenzintervall von 95 % und einem zweiseitigen P-Wert wurde verwendet, um die mögliche lineare Korrelation zwischen dem Schweregrad der Steatose im Hinblick auf die Lipidtröpfchenanalyse und die CYP-Aktivität zu bewerten. Außerdem wurde die lineare Korrelation zwischen makrovesikulärer bzw. mikrovesikulärer Steatose und der AUC mit GraphPad Prism bewertet. Eine lineare Korrelation (R-Wert) kleiner als Null weist auf eine negative Korrelation hin, während ein R-Wert größer als Null auf eine positive Korrelation hinweist. Die Korrelation wurde bei einem R-Wert ≥ 0,7 als stark, bei einem R-Wert zwischen 0,7 und 0,5 als mäßig, bei einem R-Wert zwischen 0,5 und 0,3 als mittelmäßig und bei einem R-Wert < als vernachlässigbar angesehen 0,3, unabhängig davon, ob der Koeffizient positiv oder negativ ist68.

Die Korrelationsmatrix wurde mithilfe der Pearson-Korrelation berechnet. Die p-Werte wurden für mehrere Tests mithilfe der Benjamini- und Hochberg-Methode angepasst. Die Analyse wurde mit R Version 4.2.1 und dem Paket corrplot durchgeführt.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den aktuellen deutschen Tierschutzvorschriften und -richtlinien sowie den ARRIVE-Richtlinien zur Meldung von Tierversuchen durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland) genehmigt (Genehmigungsnummer: UKJ-19-020).

In dieser Studie wurden öffentlich verfügbare Datensätze analysiert. Diese Daten finden Sie hier im FAIRDOMHub-Repository zum Teilen systembiologischer Forschung69 (https://doi.org/10.15490/FAIRDOMHUB.1.STUDY.1070.1).

Garza, AZ, Park, SB & Kocz, R. Drogeneliminierung. [Aktualisiert am 11. Juli 2022]. In: StatPearls [Internet]. (StatPearls Publishing, 2022). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK547662/.

Almazroo, OA, Miah, MK & Venkataramanan, R. Arzneimittelstoffwechsel in der Leber. Klin. Leber Dis. 21, 1. https://doi.org/10.1016/j.cld.2016.08.001 (2017).

Artikel Google Scholar

Lindros, KO Zonierung der Cytochrom P450-Expression, des Arzneimittelstoffwechsels und der Toxizität in der Leber. General Pharmacol. 28, 191–196. https://doi.org/10.1016/s0306-3623(96)00183-8 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Colnot, S. & Perret, C. In Molecular Pathology of Liver Diseases 7–16 (Springer, 2011).

Soto-Gutierrez, A., Gough, A., Vernetti, LA, Taylor, DL & Monga, SP Präklinische und klinische Untersuchungen der metabolischen Zonierung bei Lebererkrankungen: Das Potenzial mikrophysiologischer Systeme. Exp. Biol. Med. (Maywood) 242, 1605–1616. https://doi.org/10.1177/1535370217707731 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Kietzmann, T. Metabolische Zonierung der Leber: Der Sauerstoffgradient erneut betrachtet. Redox-Biol. 11, 622–630. https://doi.org/10.1016/j.redox.2017.01.012 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Gebhardt, R. & Matz-Soja, M. Leberzonierung: Neue Aspekte ihrer Regulierung und ihr Einfluss auf die Homöostase. Welt J. Gastroenterol. 20, 8491–8504. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i26.8491 (2014).

Artikel Google Scholar

Ghallab, A. et al. Einfluss der Leberfibrose auf die lobuläre Zonierung. Zellen https://doi.org/10.3390/cells8121556 (2019).

Artikel Google Scholar

Weltman, MD, Farrell, GC & Liddle, C. Erhöhte Hepatozyten-CYP2E1-Expression in einem Ratten-Ernährungsmodell für Lebersteatose mit Entzündung. Gastroenterologie 111, 1645–1653. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(96)70028-8 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Bell, LN et al. Durch bariatrische Chirurgie verursachter Gewichtsverlust verringert die Lipidperoxidation in der Leber und beeinflusst den Gehalt an Cytochrom P-450-Protein in der Leber. Ann. Surg. 251, 1041–1048. https://doi.org/10.1097/SLA.0b013e3181dbb572 (2010).

Artikel Google Scholar

Hata, S. et al. Cytochrom 3A und 2E1 im menschlichen Lebergewebe: Individuelle Variationen bei normalen japanischen Probanden. Lebenswissenschaft. 86, 393–401. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2010.01.011 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Stärkel, P. et al. Oxidativer Stress, KLF6 und die Hochregulierung des transformierenden Wachstumsfaktors Beta unterscheiden bei Ratten eine nichtalkoholische Steatohepatitis, die zu einer Fibrose fortschreitet, von einer unkomplizierten Steatose. J. Hepatol. 39, 538–546. https://doi.org/10.1016/s0168-8278(03)00360-x (2003).

Artikel Google Scholar

Kostrzewski, T. et al. Dreidimensional perfundiertes menschliches In-vitro-Modell einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung. Welt J. Gastroenterol. 23, 204–215. https://doi.org/10.3748/wjg.v23.i2.204 (2017).

Artikel Google Scholar

Rey-Bedon, C. et al. CYP450-Arzneimittelinduzierbarkeit bei NAFLD anhand eines In-vitro-Lebermodells: Verständnis der Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen in der Fettleber. Biomed. Pharmakotherapeut. 146, 112377. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.112377 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Jiang, W., Guo, MH & Hai, X. Hepatoprotektive und antioxidative Wirkung von Lycopin auf nichtalkoholische Fettlebererkrankungen bei Ratten. Welt J. Gastroenterol. 22, 10180–10188. https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i46.10180 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Weltman, MD, Farrell, GC, Hall, P., Ingelman-Sundberg, M. & Liddle, C. Das hepatische Cytochrom P450 2E1 ist bei Patienten mit nichtalkoholischer Steatohepatitis erhöht. Hepatology 27, 128–133 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Fisher, CD et al. Veränderungen des hepatischen Cytochrom-P450-Enzyms bei Menschen mit fortschreitenden Stadien einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung. Arzneimittel-Metabol. Dispos. 37, 2087–2094. https://doi.org/10.1124/dmd.109.027466 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Cobbina, E. & Akhlaghi, F. Nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) – Pathogenese, Klassifizierung und Wirkung auf Arzneimittel metabolisierende Enzyme und Transporter. Arzneimittel-Metabol. Rev. 49, 197–211. https://doi.org/10.1080/03602532.2017.1293683 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Schenk, A. et al. Physiologisch basierte Modellierungen bei Mäusen deuten auf einen verstärkten Verlust der Clearance-Kapazität nach einer toxischen Leberschädigung hin. Wissenschaft. Rep. 7, 6224. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04574-z (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Seebacher, F., Zeigerer, A., Kory, N. & Krahmer, N. Hepatische Lipidtröpfchenhomöostase und Fettlebererkrankung. Semin. Zellentwickler. Biol. 108, 72–81. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2020.04.011 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Mashek, DG Hepatische Lipidtröpfchen: Ein Balanceakt zwischen Energiespeicherung und Stoffwechselstörung bei NAFLD. Mol. Metab. https://doi.org/10.1016/j.molmet.2020.101115 (2020).

Artikel Google Scholar

Brunt, EM Pathologie der Fettlebererkrankung. Mod. Pathol. 20 (Beilage 1), S40-48. https://doi.org/10.1038/modpathol.3800680 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Schwen, LO et al. Zonierte Quantifizierung der Steatose in einer gesamten Mäuseleber. Berechnen. Biol. Med. 73, 108–118. https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2016.04.004 (2016).

Artikel Google Scholar

Homeyer, A. et al. Fokussierte Scores ermöglichen eine zuverlässige Unterscheidung kleiner Unterschiede in der Steatose. Diag. Pathol. 13, 76. https://doi.org/10.1186/s13000-018-0753-5 (2018).

Artikel Google Scholar

Gluchowski, NL, Becuwe, M., Walther, TC & Farese, RV Jr. Lipidtröpfchen und Lebererkrankungen: Von der grundlegenden Biologie bis zu klinischen Implikationen. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 14, 343–355. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.32 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Sun, J. Induktion einer Fettleber bei Lewis-Ratten unter Verwendung verschiedener Diäten. Doktorarbeit in Medizin, Universität Duisburg-Essen (2011).

Zhong, F., Zhou, X., Xu, J. & Gao, L. Nagetiermodelle der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung. Verdauung 101, 522–535. https://doi.org/10.1159/000501851 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Satapathy, SK, Kuwajima, V., Nadelson, J., Atiq, O. & Sanyal, AJ Medikamenteninduzierte Fettlebererkrankung: Ein Überblick über Pathogenese und Management. Ann. Hepatol. 14, 789–806. https://doi.org/10.5604/16652681.1171749 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Miele, L. et al. Fettleber und Medikamente: die beiden Seiten derselben Medaille. EUR. Rev. Med. Pharmakol. Wissenschaft. 21, 86–94 (2017).

CAS Google Scholar

Fromenty, B. Hemmung der mitochondrialen Fettsäureoxidation bei medikamenteninduzierter Lebersteatose. Leberres. 3, 157–169 (2019).

Artikel Google Scholar

Silva, GH, Hessel, G., Coelho, KIR & Escanhoela, CAF Steatose unbestimmter Ursache in einer pädiatrischen Gruppe: Handelt es sich um eine primäre mitochondriale Hepatopathie? Sao Paulo Med. J. 129, 217–223. https://doi.org/10.1590/S1516-31802011000400004 (2011).

Artikel Google Scholar

Homeyer, A. et al. Schnelle und genaue Identifizierung von Fetttröpfchen in histologischen Bildern. Berechnen. Methoden Progr. Biomed. 121, 59–65. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2015.05.009 (2015).

Artikel Google Scholar

Marsman, H. et al. Beurteilung der Spenderlebersteatose: Pathologe oder automatisierte Software? Summen. Pathol. 35, 430–435. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2003.10.029 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Yersiz, H. et al. Beurteilung der Lebersteatose durch einen Transplantationschirurgen und einen erfahrenen Pathologen: Eine prospektive, doppelblinde Untersuchung von 201 Spenderlebern. Leber-Transplantation. 19, 437–449. https://doi.org/10.1002/lt.23615 (2013).

Artikel Google Scholar

Meihong, D. et al. Begrenzte Korrelation zwischen konventionellem Pathologen und automatischer computergestützter Quantifizierung der Lebersteatose aufgrund des Unterschieds zwischen ereignisbasierter und oberflächenbasierter Analyse. IEEE J. Biomed. Gesundheit 18, 1473–1477. https://doi.org/10.1109/jbhi.2013.2282999 (2014).

Artikel Google Scholar

Kleiner, DE et al. Entwurf und Validierung eines histologischen Bewertungssystems für nichtalkoholische Fettlebererkrankungen. Hepatologie 41, 1313–1321. https://doi.org/10.1002/hep.20701 (2005).

Artikel Google Scholar

Zhang, L. et al. Durch ernährungsbedingte Fettleibigkeit verändert sich die Expression und Funktion von Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen und Transportern in der Leber bei Ratten. Biochem. Pharmakol. 164, 368–376. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2019.05.002 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Li, H. et al. In-vivo-Cytochrom-P450-Aktivitätsveränderungen bei Mäusen mit diabetischer nichtalkoholischer Steatohepatitis. J. Biochem. Mol. Toxicol. 31, e21840. https://doi.org/10.1002/jbt.21840 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Jamwal, R. et al. Multiplex- und markierungsfreier relativer Quantifizierungsansatz zur Untersuchung der Proteinhäufigkeit von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen in menschlichen Lebermikrosomen mittels SWATH-MS. J. Proteome Res. 16, 4134–4143. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.7b00505 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Massart, J., Begriche, K., Hartman, JH & Fromenty, B. Rolle des mitochondrialen Cytochroms P450 2E1 in gesunder und erkrankter Leber. Zellen https://doi.org/10.3390/cells11020288 (2022).

Artikel Google Scholar

Zhang, XB et al. Verminderte Expression von hepatischem Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) in einem Mausmodell mit chronischer intermittierender Hypoxie. J. Thorac. Dis. 10, 825–834. https://doi.org/10.21037/jtd.2017.12.106 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Woolsey, SJ, Mansell, SE, Kim, RB, Tirona, RG & Beaton, MD CYP3A-Aktivität und -Expression bei nichtalkoholischer Fettlebererkrankung. Arzneimittel-Metabol. Dispos. 43, 1484–1490. https://doi.org/10.1124/dmd.115.065979 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Kolwankar, D. et al. Zusammenhang zwischen nichtalkoholischer Lebersteatose und hepatischer Cytochrom P-450 3A-Aktivität. Klin. Gastroenterol. Hepatol. 5, 388–393. https://doi.org/10.1016/j.cgh.2006.12.021 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Tag, CP Vom Fett zur Entzündung. Gastroenterologie 130, 207–210. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2005.11.017 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Baillie, TA & Rettie, AE Rolle der Biotransformation bei arzneimittelinduzierter Toxizität: Einfluss von Unterschieden innerhalb und zwischen den Spezies im Arzneimittelstoffwechsel. Arzneimittel-Metabol. Pharmakok. 26, 15–29. https://doi.org/10.2133/dmpk.DMPK-10-RV-089 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

van Waterschoot, RA et al. Der Midazolam-Metabolismus in Cytochrom-P450-3A-Knockout-Mäusen kann auf hochregulierte CYP2C-Enzyme zurückgeführt werden. Mol. Pharmakol. 73, 1029–1036. https://doi.org/10.1124/mol.107.043869 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Tachikawa, M. et al. Leberzonierungsindex der Proteinexpression von Arzneimitteltransportern und metabolisierenden Enzymen im Leber-Azinus von Mäusen. Arzneimittel-Metabol. Dispos. 46, 610–618. https://doi.org/10.1124/dmd.117.079244 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kulkarni, NM et al. Veränderte Pharmakokinetik von Rosiglitazon in einem Mausmodell einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung. Arzneimittel. Metab. Pers. Dort. 31, 165–171. https://doi.org/10.1515/dmpt-2016-0008 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Lickteig, AJ et al. Die Expression des Efflux-Transporters und die Ausscheidung des Paracetamol-Metaboliten sind in Nagetiermodellen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung verändert. Arzneimittel-Metabol. Dispos. 35, 1970–1978. https://doi.org/10.1124/dmd.107.015107 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Bang, WS, Hwang, YR, Li, Z., Lee, I. & Kang, HE Auswirkungen einer durch Orotsäure induzierten nichtalkoholischen Fettleber auf die Pharmakokinetik von Metoprolol und seinen Metaboliten bei Ratten. J. Pharm. Pharm. Wissenschaft. 22, 98–111. https://doi.org/10.18433/jpps30268 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Campos, G. et al. Entzündungsbedingte Unterdrückung metabolischer Gennetzwerke bei akuten und chronischen Lebererkrankungen. Bogen. Toxicol. 94, 205–217. https://doi.org/10.1007/s00204-019-02630-3 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Ramadori, G. & Christ, B. Zytokine und die hepatische Akute-Phase-Reaktion. Semin. Leber Dis. 19, 141–155. https://doi.org/10.1055/s-2007-1007106 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Turner, PV, Brabb, T., Pekow, C. & Vasbinder, MA Verabreichung von Substanzen an Labortiere: Verabreichungswege und zu berücksichtigende Faktoren. Marmelade. Assoc. Labor. Anim. Wissenschaft. 50, 600–613 (2011).

CAS Google Scholar

Kleeberg, U. & Klinger, W. Empfindliche Formaldehydbestimmung mit Nashs-Reagenz und einer Tryptophan-Reaktion. J. Pharmacol. Methode 8, 19–31. https://doi.org/10.1016/0160-5402(82)90004-3 (1982).

Artikel CAS Google Scholar

Aitio, A. Ein einfacher und empfindlicher Test der 7-Ethoxycumarin-Deethylierung. Anal. Biochem. 85, 488–491. https://doi.org/10.1016/0003-2697(78)90245-2 (1978).

Artikel CAS Google Scholar

Pohl, RJ & Fouts, JR Eine schnelle Methode zur Untersuchung des Metabolismus von 7-Ethoxyresorufin durch mikrosomale subzelluläre Fraktionen. Anal. Biochem. 107, 150–155. https://doi.org/10.1016/0003-2697(80)90505-9 (1980).

Artikel CAS Google Scholar

Chang, TK, Crespi, CL & Waxman, DJ Spektrophotometrische Analyse der humanen CYP2E1-katalysierten p-Nitrophenol-Hydroxylierung. Methoden Mol. Biol. 320, 127–131. https://doi.org/10.1385/1-59259-998-2:127 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Newville, M. et al. LMFIT: Nichtlineare Minimierung der kleinsten Quadrate und Kurvenanpassung für Python. Astrophysics Source Code Library, ascl: 1606.1014 (2016).

Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: Grundlegende Algorithmen für wissenschaftliches Rechnen in Python. Nat. Methoden 17, 261–272. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0686-2 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Hucka, M. et al. Die Systems Biology Markup Language (SBML): Ein Medium zur Darstellung und zum Austausch biochemischer Netzwerkmodelle. Bioinformatik 19, 524–531. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btg015 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Keating, SM et al. SBML Level 3: Ein erweiterbares Format für den Austausch und die Wiederverwendung biologischer Modelle. Mol. Syst. Biol. 16, e9110. https://doi.org/10.15252/msb.20199110 (2020).

Artikel Google Scholar

Schmiester, L. et al. PEtab-Interoperable Spezifikation von Parameterschätzungsproblemen in der Systembiologie. PLoS Comput. Biol. 17, e1008646. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008646 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Vanhoefer, J., Matos, M., Pathirana, D., Schälte, Y. & Hasenauer, J. yaml2sbml: Vom Menschen lesbare und beschreibbare Spezifikation von ODE-Modellen und deren Konvertierung in SBML. J. Open Source Softw. 6, 3215. https://doi.org/10.21105/joss.03215 (2021).

Artikel ADS Google Scholar

Schälte, Y. et al. pyPESTO—Parameter EStimation TOolbox for python (0.2.7). https://doi.org/10.5281/zenodo.6606687 (2021).

Vousden, WD, Farr, WM & Mandel, I. Dynamische Temperaturauswahl für paralleles Tempern in Markov-Ketten-Monte-Carlo-Simulationen. Mo. Nicht. R. Astron. Soc. 455, 1919–1937. https://doi.org/10.1093/mnras/stv2422 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Geweke, JF Bewertung der Genauigkeit stichprobenbasierter Ansätze zur Berechnung posteriorer Momente. Bericht Nr. Staff Report 148, (Federal Reserve Bank of Minneapolis, 1991).

Fröhlich, F. et al. AMICI: Hochleistungs-Sensitivitätsanalyse für große gewöhnliche Differentialgleichungsmodelle. Bioinformatik 37, 3676–3677 (2021).

Artikel Google Scholar

Mukaka, MM Statistics Corner: Ein Leitfaden zur angemessenen Verwendung des Korrelationskoeffizienten in der medizinischen Forschung. Malawi Med. J. 24, 69–71 (2012).

CAS Google Scholar

Wolstencroft, K. et al. FAIRDOMHub: Eine Repository- und Kollaborationsumgebung für den Austausch systembiologischer Forschung. Nukleinsäuren Res. 45, D404–D407. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1032 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

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Wir möchten Ana Paz, Isabel Jank, Haotian Chen und Sadaf Khalatbarizamanpoor für die hervorragende technische Unterstützung während des Experiments danken.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Forschung wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), „SteaPKMod, Fördernummer 410848700“ und „FOR 5151 QuaLiPerF, Fördernummer 436883643“ und „SimLivA, Fördernummer 465194077“. MK wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Deutschland) im Rahmen des Forschungsnetzwerks Systemmedizin der Leber (LiSyM, Fördernummer 031L0054) gefördert.

Experimentelle Transplantationschirurgie, Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Gefäßchirurgie, Universitätsklinikum Jena, Jena, Deutschland

Mohamed Albadry, Nadia Ehteshamzad und Uta Dahmen

Abteilung für Pathologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Menoufia-Universität, Shebin Elkom, Menoufia, Ägypten

Mohamed Albadry

Institut für Systemtheorie und Regelungstechnik, Fakultät für Ingenieurkonstruktion, Produktionstechnik und Fahrzeugtechnik, Universität Stuttgart, Stuttgart, Deutschland

Sebastian Höpfl & Nicole Radde

Institut für Theoretische Biologie, Institut für Biologie, Humboldt-Universität, Berlin, Deutschland

Matthias König

MVZ Medizinische Labore Dessau Kassel GmbH, Bauhüttenstraße 6, 06847, Dessau-Roßlau, Germany

Michael Böttcher & Jasna Neumann

Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Jena, Jena, Deutschland

Amelie Lupp

Institut für Pathologie, Klinikum Chemnitz, Chemnitz, Deutschland

Olaf Dirsch

Labor für Zelltransplantation/Molekulare Hepatologie, Abteilung für Viszeral-, Transplantations-, Thorax- und Gefäßchirurgie, Universitätsklinikum Leipzig, Deutschland

Bruno Christ & Madlen Christ

Fraunhofer MEVIS, Max-Von-Laue-Str. 2, 28359, Bremen, Germany

Lars Ole Schwen & Hendrik Laue

Institute of Veterinary Pathology, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Robert Klopfleisch

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Konzeptualisierung, UD, OS, OD, MA, HL; Methodik: UD, OD, MA, SH, AL, BC, MC; Software, HL; Validierung: MB, MA; Formale Analyse, MA, SH, HL, MK; Untersuchung, MA, NE, MB, AL, BC, MC; Ressourcen, UD, MB, BC, AL; Datenkuration; HL, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, MA, SH, MB, AL, UD; Schreiben, Rezensieren und Bearbeiten, alle Autoren; Visualisierung, MA, SH; Aufsicht, UD, OS; Projektadministration, UD, OS; Finanzierungseinwerbung, UD, OS, NR Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Correspondence to Uta Dahmen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Albadry, M., Höpfl, S., Ehteshamzad, N. et al. Periportale Steatose bei Mäusen beeinflusst bestimmte Parameter des perizentralen Arzneimittelstoffwechsels. Sci Rep 12, 21825 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26483-6

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 15. Dezember 2022

Veröffentlicht: 17. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26483-6

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