Mindestanforderungen für die ISO15189-Validierung und Akkreditierung von drei Sequenzierungsverfahren der nächsten Generation für SARS

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6934 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der schnelle und wiederkehrende Durchbruch neuer SARS-CoV-2-Stämme (Varianten) hat Gesundheitsbehörden weltweit dazu veranlasst, Überwachungsnetzwerke einzurichten, um die Verbreitung besorgniserregender Varianten zu überwachen. Der Einsatz von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation hat den Bedarf an Qualitätskontrollbewertungen erhöht, wie sie in klinischen Labors erforderlich sind. Die vorliegende Studie ist die erste, die einen Validierungsleitfaden für die SARS-CoV-2-Typisierung unter Verwendung von drei verschiedenen NGS-Methoden vorschlägt, die die ISO15189-Standards erfüllen. Dazu gehört die Bewertung des Risikos, der Spezifität, der Genauigkeit, der Reproduzierbarkeit und der Wiederholbarkeit der Methoden. Von den drei verwendeten Methoden basieren zwei auf Amplikons und umfassen die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (Artic v3 und Midnight v1) auf Oxford Nanopore Technologies, während die dritte auf Amplikons-Basis und auf der Reverse-Komplement-Polymerase-Kettenreaktion (Nimagen) auf Illumina-Technologie basiert. Wir haben festgestellt, dass alle Methoden die Qualitätsanforderungen (z. B. 100 % übereinstimmende Typisierungsergebnisse hinsichtlich Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit) für die SARS-CoV-2-Typisierung im klinischen Umfeld erfüllten. Darüber hinaus wurden die Typisierungsergebnisse der einzelnen drei Sequenzierungsmethoden anhand dreier weithin bekannter Nomenklaturen (WHO, Pangolineage und Nextclade) verglichen. Sie wurden auch hinsichtlich einzelner Nukleotidvariationen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass Artic v3 und Nimagen für die Ausbruchsuntersuchung bevorzugt werden sollten, da sie qualitativ hochwertigere Ergebnisse für Proben liefern, die die Einschlusskriterien für die Analyse in einem klinischen Umfeld nicht erfüllen. Diese Studie ist ein erster Schritt zur Validierung laborentwickelter NGS-Tests im Kontext der neuen europäischen Verordnung für Medizinprodukte und In-vitro-Diagnostika.

Coronaviren sind umhüllte einzelsträngige RNA-Viren, die bei Säugetieren und Vögeln weit verbreitet sind und eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Atemwegsinfektionen, verursachen. Diese Viren verfügen über eine große genetische Vielfalt und eine hohe Fähigkeit, genetische Rekombinationen und Mutationen durchzuführen1,2. Ende 2019 wurde ein neues Mitglied der Coronavirus-Unterfamilie namens SARS-CoV-2 erstmals in China (Wuhan) entdeckt und war für die darauf folgende beispiellose globale Pandemie verantwortlich. Trotz der geringen Mutationshäufigkeit im Vergleich zu anderen RNA-Viren3 erhöht die hohe Übertragungsrate von SARS-CoV-2 beim Menschen die Wahrscheinlichkeit des Erwerbs einer Mutation und der daraus resultierenden Evolution. Daher sind im Laufe der Zeit viele Varianten von SARS-CoV-2 entstanden, darunter interessante Varianten und besorgniserregende Varianten (VOCs). Letztere weisen eine höhere Übertragbarkeit und/oder Fähigkeit zur Umgehung der Immunität auf als zuvor zirkulierende Stämme3,4,5,6.

Die meisten Länder haben versucht, neue Infektionswellen durch die Umsetzung öffentlicher Gesundheitsmaßnahmen einzudämmen, um eine Überflutung von Gesundheitseinrichtungen zu verhindern und so den Zugang zur Gesundheitsversorgung für Menschen zu gewährleisten, die eine lebenswichtige Behandlung benötigen. In diesem Zusammenhang war es von wesentlicher Bedeutung, ein effizientes Überwachungsnetzwerk zu entwickeln, das die frühzeitige Erkennung neuer zirkulierender Varianten und deren Übertragung in der Bevölkerung ermöglicht7,8. Die Sequenzierung des gesamten Genoms hilft Wissenschaftlern nicht nur bei der Untersuchung des Virus und der Entwicklung von Impfstoffen, sondern ist auch das wichtigste Instrument für den Aufbau starker Überwachungsnetzwerke.

Das gesamte SARS-CoV-2-Genom wurde erstmals Anfang 2020 mithilfe virusinfizierter Zellen und der Kombination mehrerer Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien (z. B. Illumina und Oxford Nanopore Technologies) sequenziert9. Beide Technologien werden weltweit immer noch häufig eingesetzt, um Sequenzen zirkulierender Stämme zu erhalten5,6,7,10,11. Im September 2020 identifizierte das britische nationale Sequenzierungsnetzwerk namens Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Genomics UK Consortium die erste VOC, die heute als Alpha-Variante (B.1.1.7) bekannt ist. Diese Variante von SARS-CoV-2 ist durch die HV69-70-Deletion und die N501Y-Aminosäuremutation gekennzeichnet. Er konnte sich sehr schnell verbreiten und wies im Vergleich zum ersten in Wuhan identifizierten Stamm insgesamt 14 linienspezifische Aminosäureaustausche auf, darunter drei Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie epidemiologische Vorteile mit sich bringen (d. h. N501Y, 69-70-Deletion, P681H)7,12 . Seitdem wurden weltweit vier Hauptvarianten identifiziert, die Anlass zur Sorge geben: Beta (K417N, E484K), Gamma (K417T, V1176F), Delta (L19R, L452R, 157-158-Deletion, L452R, T478K, D950N) und das neueste Omicron (R346K, L452X, F486V) Variante. Jede dieser Varianten weist akkumulierte Mutationen auf, die ihnen evolutionäre Vorteile verschaffen, bis hin zu den derzeit am weitesten verbreiteten Omicron-Varianten, die mehr als 60 Mutationen im Vergleich zum Wuhan-Referenzgenom erworben haben6,13,14.

Obwohl viele Länder unterschiedliche Überwachungsstrategien zur Überwachung von VOCs eingeführt haben, wurde NGS zur weit verbreiteten Eckpfeilerstrategie. NGS-Technologien wurden in vielen Labors, darunter auch medizinischen Labors, implementiert. Während NGS ein qualitatives Verfahren ist, mit dem praktisch eine unbegrenzte Anzahl von Zielen nachgewiesen werden kann15,16, sind die meisten Standards und Empfehlungen für molekularbiologische Analysen im klinischen Umfeld auf quantitative Einzelanalyttests ausgelegt15. Daher sind geeignete Qualitätskontroll- und Validierungsmethoden erforderlich, um die Zuverlässigkeit der von NGS generierten Sequenzierungsdaten sicherzustellen. Im Mai 2017 veröffentlichten das Europäische Parlament und der Rat neue Verordnungen über Medizinprodukte (Verordnung (EU) 2017/745) und In-vitro-Diagnostika (Verordnung (EU) 2017/746), auch IVDR genannt, mit dem Ziel, die zu verbessern Qualität und Sicherheit der klinischen Diagnostik. Diese Standards erhöhen die Anzahl und Vielfalt der Qualitätsanforderungen für die Validierung von im Labor entwickelten Tests (Labor Developed Tests, LDTs) erheblich. Eine der Anforderungen besteht darin, dass alle LDTs von einer nationalen Akkreditierungsstelle akkreditiert sein müssen und daher den ISO15189-Standards17,18,19 entsprechen. Da es sich bei den meisten Sequenzierungsmethoden für sich schnell entwickelnde und neu auftretende Krankheitserreger um LDTs handelt, ist ihre Validierung ein erster Schritt zur Einhaltung der ISO15189-Standards und der nachfolgenden IVDR.

Diese Arbeit zielt darauf ab, veröffentlichte Daten zu SARS-CoV-2-Sequenzierungsmethoden, hauptsächlich Qualitätskriterien20 und externe Qualitätsbewertungsberichte21, durch eine Verbesserung der Qualitätskontrolle zu ergänzen. Tatsächlich wurden die hier beschriebenen Methoden weitgehend verwendet und auf ihre Grenzen hin bewertet22,23,2425,26, es fehlen jedoch Validierungsverfahren. Die vorliegende Arbeit schlägt einen Validierungsleitfaden für SARS-CoV-2-Typisierungs-Standardarbeitsanweisungen (SOP) unter Verwendung von NGS und gemäß den ISO15189-Akkreditierungsstandards vor. Darüber hinaus wurden die Fähigkeiten zur Typisierung und Identifizierung einzelner Nukleotidvariationen (SNVs) von drei validierten SOPs verglichen. Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die einen vollständigen Validierungsprozess für SARS-CoV-2-Genomsequenzierungs-SOPs vorschlägt, der den ISO15189-Standards entspricht und zur Akkreditierung der Methoden durch eine nationale Akkreditierungsstelle führt, ein erster Schritt in diese Richtung IVDR-Implementierung im klinischen Umfeld.

Klinische Proben (Nasopharyngealabstrich in UTM oder Zymo-Medium) wurden von symptomatischen oder Hochrisiko-Kontaktpatienten nur zu diagnostischen Zwecken zwischen Mai 2021 und Januar 2022 entnommen, wie damals von den nationalen Gesundheitsbehörden empfohlen, und positiv auf SARS-CoV getestet. 2 am CHU UCL Namur oder an der Clinique Saint-Pierre Ottignies mit dem Allplex®2019-CoV-Assay (Seegene, Seoul, Korea) oder dem TaqPath COVID-19 CE-IVD RT-PCR Kit (Thermo Fisher Scientific; MA, USA). Erkennen Sie SARS-CoV-2, indem Sie auf vier Gene (N, E und RdRP/S) bzw. drei Gene (N, S und ORF1) abzielen. Für die technische Validierung der NGS-Methoden wurden 55 Restproben mit einem breiten N-Gen-qPCR-Ct-Wert-Bereich (von 12,4 bis 35,9) ausgewählt.

Die Gesamt-RNA wurde mit zwei verschiedenen Methoden direkt aus den klinischen Proben extrahiert.

Für die Illumina-Sequenzierung wurden Nukleinsäuren unter Verwendung des automatisierten Liquid-Handling-Systems Hamilton Microlab STARlet (Accuramed; Halen, Belgien) mit dem STARMag Viral DNA/RNA 200 C-Kit (Seegene; Seoul, Südkorea) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Der gesamte Vorgang für vierundzwanzig Proben dauerte 1 Stunde und 15 Minuten (praktische Zeit: 15 Minuten).

Für Oxford Nanopore Technologies (ONT) wurden Nukleinsäuren mit dem Applied Biosystem\(^{\textrm{TM}}\) MagMAX\(^{\textrm{TM}}\) Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit extrahiert ( Thermo Fisher Scientific; MA, USA) mit dem automatisierten System KingFisher Flex96 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA). Proteinase K und Bindungskügelchen wurden zu klinischen Proben gegeben, die zuvor in eine 96er-Deep-Well-Platte gegeben wurden. Die Platten wurden im KingFisher Flex96 eingeführt und das MVP_2Wash_200_Flex-Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Der gesamte Vorgang für 24 Proben dauerte 45 Minuten (praktische Zeit: 20 Minuten).

Die umgekehrte Transkription von RNA-Extrakten wurde mit dem NEBNext®LunaScript®RT SuperMix Kit 5x (New England Biolabs; MA, USA) durchgeführt. Gemäß der Standardarbeitsanweisung (SOP) von Illumina wurden 6 μl RNA mit 2,4 μl des Enzyms, verdünnt in 3,6 μl nukleasefreiem Wasser, gemischt. Gemäß ONT SOP wurden 8 \(\upmu\)L ARN mit 2\(\upmu\)L Enzym gemischt. Die Mischungen wurden 2 Minuten lang bei 25 °C inkubiert (Annealing der Poly-dT-Primer), 20 Minuten lang bei 55 °C für das Illumina SOP oder 10 Minuten für ONT SOPs (cDNA-Synthese) und schließlich bei 95 \(^{\circ }\)C für 1 Minute (Enzyminaktivierung). Der gesamte Vorgang für vierundzwanzig Proben dauerte 20 Minuten für ONT-SOPs und 30 Minuten für die Illumina-SOP.

Die cDNA wurde mit dem EasySeq\(^{\textrm{TM}}\) SARS-CoV-2 WGS Library Prep Kit (Nimagen BV; Nijmegen, Niederlande), im Folgenden Nimagen genannt, unter Verwendung der Reverse Complement PCR (RC-PCR)-Technologie amplifiziert das produziert kurze Amplikons (ca. 200 bp). Diese Technologie ermöglicht die Amplifikation von cDNA unter Verwendung von zwei Arten von Primern: zielspezifische Primer mit einem universellen Schwanz und universelle Primer, die zur Probenidentifizierung an Illumina-Adaptersequenzen und an die Indexsequenzen i5 und i7 gekoppelt sind27. Für jede Probe wurden zwei RC-PCRs (A und B) mit zwei Primerpools durchgeführt, die das gesamte SARS-CoV-2-Genom abdecken. cDNA (5 μl) jeder Probe wurde mit 0,2 μl Sondenpanel A oder B separat, 0,8 μl Sondenverdünnungspuffer und 10 μl gemischt. \upmu\)L 2x Master-Mix. Die Proben wurden zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA 2 Minuten lang bei 98 \(^{\circ }\)C inkubiert. Als nächstes wurden funktionelle zielgerichtete Indexprimer (Kombination aus zielspezifischen Primern und universellen Primern) durch Inkubation der Proben bei 98 \(^{\circ }\)C für 10 s und bei 80 \(^{\circ }\) erzeugt. C für 1 s, bei 58 \(^{\circ }\)C für 10 min und bei 72 \(^{\circ }\)C für 1 min. Dann wurden Indizes, Sequenzadapter und universelle Enden an die 5'- und 3'-Enden der Ziel-DNA-Fragmente angefügt, indem zwei Inkubationszyklen bei 98 \(^{\circ }\)C für 10 s und 80 \(^{\) durchgeführt wurden. circ }\)C für 1 s, 62 \(^{\circ }\)C für 90 min und für 2 min bei 72 \(^{\circ }\)C. Schließlich wurden cDNA-Fragmente mit Indizes, Sequenzadaptern und universellen Enden amplifiziert, indem 40 Inkubationszyklen bei 95 \(^{\circ }\)C für 10 s und 80 \(^{\circ }\)C für 1 s durchgeführt wurden , 62 \(^{\circ }\)C für 2 min und 72 \(^{\circ }\)C für 1 min. Der gesamte Vorgang für 24 Proben dauerte 7 Stunden (praktische Zeit: 30 Minuten).

Die cDNA wurde mit zwei Multiplex-PCRs amplifiziert, die jeweils einen Pool spezifischer Primer (A und B) (Integrated DNA Technologies; Iowa, USA) umfassten, um das gesamte SARS-CoV-2-Genom abzudecken. Entweder mit kurzen Amplikons um 400 bp für die Artic nCoV 2019-Sequenzierungs-SOP v322, im Folgenden Artic v3 genannt, oder mit längeren Amplikons um 1200 bp für die nCoV 2019-Rapid-Barcoding-Sequenzierungs-SOP v123, im Folgenden Midnight v1 genannt. 2,5 μl cDNA wurden mit 0,4 μl (Artic v3 SOP) oder 0,11 μl (Midnight v1 SOP) der Primerpools A oder B separat gemischt, 12,5 μl. (\upmu\)L von Q5®Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs; MA, USA) und 9,6 \(\upmu\)L (Artic v3 SOP) oder 9,89 \(\upmu\)L (Midnight v1 SOP) mit nukleasefreiem Wasser gewaschen und 30 s lang bei 98 \(^{\circ }\)C inkubiert (Wärmeaktivierung), gefolgt von 30 (Artic v3 SOP) oder 32 Zyklen (Midnight v1 SOP) Inkubation bei 98 \(^{\circ }\)C für 15 s und 65 \(^{\circ }\)C für 5 min (Primer-Annealing und Elongation). Der gesamte Vorgang für vierundzwanzig Proben dauerte für beide SOPs 3 Stunden und 15 Minuten (praktische Zeit: 30 Minuten).

Alle RC-PCR-amplifizierten cDNA-A- und -B-Produkte wurden separat gepoolt. Um die Lesetiefe zwischen den Proben während der Sequenzierung zu homogenisieren, hängt das in die Pools eingeführte Probenvolumen von der Viruslast jeder Probe ab: 2 \(\upmu\)L, wenn der qPCR-Ct-Wert <20, 4 \(\upmu\)L wenn 20\(\le\) qPCR-Ct-Wert \(\le\)25 oder 8 \(\upmu\)L, wenn qPCR-Ct-Wert > 25. 40 \(\upmu\)L jedes Pools verdünnt mit 60 \( μL RC-PCR Low-TE-Puffer (Nimagen BV; Nijmegen, Niederlande) wurden unter Verwendung von 85 μL AmplicleanTM-Magnetkügelchen (Solid Phase Reversible Immobilization, SPRI) (Nimagen BV; Nijmegen, Niederlande) gereinigt ) durch Mischen von DNA und Perlen (Verhältnis Perlen:DNA = 0,85), gefolgt von einer Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 5 Minuten, dann wurden die Perlen zweimal mit 75 % Ethanol gewaschen. Mit interessierenden DNA-Fragmenten bedeckte Perlen wurden mit 110 µl RC-PCR Low TE-Puffer (Nimagen BV; Niederlande) gemischt und 2 Minuten bei RT inkubiert. Der Reinigungsvorgang wurde ein zweites Mal wiederholt. Die eluierte DNA aus jedem Pool wurde mit dem 1xdsDNA HS-Kit (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) mit dem Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) quantifiziert und die Größe und Integrität der Amplifikate wurde mit dem QIAxcel-Fragmentanalysator (Qiagen; Hilden) überprüft , Deutschland) mit dem DNA Screening Kit (Qiagen; Hilden, Deutschland).

Jede DNA-Suspension wurde mit RC-PCR Low-TE-Puffer (Nimagen BV; Nijmegen, Niederlande) auf eine Konzentration von 2 nM verdünnt, bevor sie zusammengelegt und verdünnt wurde, um eine endgültige Bibliothekskonzentration von 80 pM zu erreichen. Der gesamte Vorgang dauerte 1h45 (praktische Zeit: 1h30).

Die amplifizierte DNA aus jeder PCR-Reaktion wurde pro Probe gepoolt und jede Probe wurde mit dem 1XdsDNA HS-Kit (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) und dem Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) quantifiziert. Die Proben wurden verdünnt, um höchstens einen Faktor 2 zwischen der am wenigsten konzentrierten und der am stärksten konzentrierten Probe zu erhalten, um die Ablesetiefe zu homogenisieren. 3,3 μl DNA wurden mit 5‘-Phosphaten und 3‘-Hydroxylen durch Zugabe von 1,2 μl Endpräparationspuffer „Ultra II“ und 0,5 μm stumpfendig gemacht. L Ultra II End Prep-Enzymmischung aus dem NEBNext®End Repair Kit (New England Biolabs; MA, USA) und 5 \(\upmu\)L nukleasefreies Wasser und bei 25 \(^{\circ }\) inkubiert. 15 Min. bei C, dann 15 Min. bei 65 \(^{\circ }\)C. 0,75 μl jeder Probe mit stumpfen Enden wurden mit 1,25 μl nativen Barcodes aus dem Native Barcoding Kit Expansion 96 (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK), 5 μm barcodiert \)L Blunt/TA-Ligase-Enzym (New England Biolabs; MA, USA) und 3 \(\upmu\)L nukleasefreies Wasser durch Inkubation der Mischungen bei 25 \(^{\circ }\)C für 20 Minuten , dann bei 65 \(^{\circ }\)C für 10 min. Alle Proben wurden gepoolt und dann mit AMPure XP-Magnetkügelchen (Beckman Coulter; CA, USA) gereinigt, indem die DNA-Bibliothek mit Kügelchen in einem Perlen:DNA-Verhältnis von 0,4 gemischt und 8 Minuten lang bei RT inkubiert wurde. Die Perlen wurden zweimal mit Kurzfragmentpuffer (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) und einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. DNA-Fragmente wurden durch 5-minütiges Inkubieren der Perlen in 30 μl nukleasefreiem Wasser bei RT eluiert.

Die DNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des 1xdsDNA HS-Kits (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) mit dem Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) quantifiziert und 30 ng doppelsträngige DNA wurden an das Adapterprotein AMII (Oxford Nanopore) ligiert Technologies; Oxford, UK) unter Verwendung von 10 µL Puffer und 5 µL Ligase aus dem NEBNext Quick Ligation Module Kit (New England Biolabs; MA, USA) und 10-minütiger Inkubation bei RT . Die DNA-Bibliothek wurde ein zweites Mal mit AMPure XP-Magnetkügelchen (Beckman Coulter; CA, USA) gereinigt, um DNA-Fragmente mit sehr hohem Molekulargewicht und nicht gebundene Proteine durch Mischen der Bibliothek mit Kügelchen (Kügelchen:DNA-Verhältnis = 1) und Inkubation bei zu entfernen RT für 5 Min. Die Perlen wurden zweimal mit Kurzfragmentpuffer (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) gewaschen und die DNA wurde durch 2-minütiges Inkubieren der Perlen in 15 µl Elutionspuffer (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) eluiert RT. Die endgültige Bibliothek wurde mit dem 1xdsDNA HS-Kit (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) und Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) quantifiziert. Die Konzentration der doppelsträngigen DNA muss mindestens 1 ng/\(\upmu\)L betragen, um mit der Sequenzierung fortfahren zu können. 37,5 μl Sequenzierungspuffer und 25,5 μl Ladeperlen, die im Sequencing Auxiliary Vials Kit (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) enthalten sind, wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Bibliothek hinzugefügt. Die gesamte Prozedur dauerte 3h30 (praktische Zeit: 2h30).

Die amplifizierte DNA aus jeder PCR-Reaktion (A und B) wurde pro Probe gepoolt. Die Proben wurden mit dem Rapid Barcoding Kit 96 (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) mit einem Barcode versehen, indem 5 μl jeder Probe mit 2,5 μl eines eindeutigen Barcodes und 2,5 μm inkubiert wurden \)L nukleasefreies Wasser bei 30 \(^{\circ }\)C für 2 Min., dann bei 80 \(^{\circ }\)C für 2 Min. Identische Volumina jeder Barcode-Probe wurden gepoolt. Die DNA-Bibliothek wurde durch SPRI mit Magnetkügelchen (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) gereinigt, indem DNA und Kügelchen gemischt wurden (Kügelchen:DNA-Verhältnis = 1) und die Mischung 5 Minuten lang bei RT inkubiert wurde. Die Perlen wurden zweimal mit 80 % Ethanol gewaschen und in 30 µl Elutionspuffer (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) inkubiert, um die DNA zu eluieren. Gereinigte DNA wurde unter Verwendung des 1XdsDNA HS-Kits (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) und des Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) quantifiziert. Zwischen 600 ng und 800 ng DNA-Bibliothek wurden mit 1 μl Adapterprotein RAPF (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) gemischt und 5 Minuten bei RT inkubiert. 37,5 μl Sequenzierungspuffer II und 25,5 μl Ladeperlen II, die im Sequencing Auxiliary Vials Kit (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) enthalten sind, wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Bibliothek hinzugefügt . Der gesamte Vorgang dauerte 50 Minuten (praktische Zeit: 40 Minuten).

Die Bibliothek wurde mit einem ISeq100-Sequenzierungssystem (Illumina; San Diego, CA, USA) in eine 300-Zyklen-iSeq100-Kassette (Illumina; San Diego, CA, USA) geladen. Für die Sequenzierung wurden folgende Parameter verwendet:

GenerateFastq-Modus

Bibliotheksvorbereitungskit: Niimagen IDX96-U01

Lesetyp: Paired-End

Leselängen: read1 = 151, index1 = 10, index2 = 10, read2 = 151

Adaptertrimmung eingeschaltet

Die R9.4-Durchflusszelle (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) wurde mit dem Flow Cell Priming Kit (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) vorbereitet und die Bibliothek auf die Durchflusszelle geladen. Sequenzierungsläufe wurden mit einem GridION (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt.

Anfängliche Vorspannung: −180 mV

Basecall-Modell: Hochpräzises Basecalling

Barcoding Artic v3-Bibliothek: barcoding_kits=EXPNBD196,trim_barcodes=“off“,require_barcodes_both_ends=“on“, detector_mid_strand_barcodes=“off“,min_score=60

Barcoding Midnight v1-Bibliothek: barcoding_kits=SQK-RBK11096, trim_barcodes=“off“, require_barcodes_both_ends=“off“, detector_mid_strand_barcodes=“on“, min_score=60, min_score_mid=50

Lesefilterung: min_qscore=9

Die Analyse der Lesevorgänge erfolgte gemäß der auf GitHub verfügbaren easyseq_covid19-Pipeline von Jordy Coolen (https://github.com/JordyCoolen/easyseq_covid19). Nach der Sequenzierung wurden die erhaltenen Lesevorgänge mit fastp (Version 0.20.1) basierend auf der Qualität der Sequenzen gefiltert. Die Lesevorgänge wurden mit der BWA-Software (Version 0.7.17) auf das SARS-CoV-2-Referenzgenom NC_045512.2 abgeglichen. Die den Primern entsprechenden Sequenzen wurden mit Bamclipper (Version 1.0.0) abgeschnitten. Die Single Nucleotide Variants (SNVs) wurden mit bcftools (Version 1.9) in Kombination mit KMA (Version 1.3.9) mit den folgenden Parametern aufgerufen: Mutationshäufigkeit \(\ge\) 75 %, Qualitätsfaktor \(\ge\) 20, Tiefe der Lesevorgänge \(\ge\) 5. Schließlich wurde die Konsenssequenz mit bcftools-Konsens (Version 1.9)24 erhalten.

Die Analyse der Sequenzierungsdaten wurde gemäß den Anweisungen von Oxford Nanopore Technologies durchgeführt. Basecalling und Demultiplexing (Verteilung von Lesevorgängen) wurden in Echtzeit durch guppybasecaller bzw. guppybarcoder durchgeführt, die beide in die MinKnow-Sequenzierungssoftware (Version 21.05.12) integriert sind.

Die weitere Datenverarbeitung erfolgte gemäß der von ARTICnetwork28 beschriebenen Bioinformatik-Pipeline. Die Reads wurden nach ihrer Qualität (Qualitätsfaktor >9) und ihrer Länge (Artic: minimale Länge = 400 bp – maximale Länge = 700 bp, Midnight: minimale Länge = 600 bp – maximale Länge = 1.200 bp) gefiltert, um chimäre Reads zu vermeiden . Die bestandenen Lesevorgänge wurden mithilfe von minimap2 (Version 2.18-r1015) auf das Referenzgenom von SARS-CoV-2 MN908947.3 abgebildet, und SNVs wurden für Positionen mit einer Lesetiefe von \(\ge\) 20 und einer Konsenssequenz, die mithilfe von Medaka erhalten wurde, aufgerufen (Version 1.4.3, Modell r941_prom_variant_g360) eine Software, die trainierte, auf neuronalen Netzwerken basierende Modelle verwendet, um Sequenzvariationen angemessen aufzurufen29.

Die molekulare Typisierung von SARS-CoV-2-Stämmen wurde anhand verschiedener Klassifizierungen durchgeführt: WHO, Nextclade und Pangolin mit den online verfügbaren Datenbanken Nextclade30 (Version 2.2.0) und Pango-designation31 (Version 1.9, Linienversion 2022-05-13).

Cohens Kappa wurde verwendet, um die paarweise Übereinstimmung zwischen zwei Listen von SNP-Aufrufen, beispielsweise A und B, zu messen, eine für jede SOP. Es wurde wie folgt berechnet.

Jede Position wird gemäß A und B als mutiert oder nicht klassifiziert, was eine Liste gepaarter Klassifizierungen ergibt, die in vier Kategorien fallen: (a) mutiert für A und B, (b) mutiert für A, aber nicht für B, (c) mutiert für B, aber nicht für A und (d) weder für A noch für B mutiert.

Der Anteil übereinstimmender Ergebnisse (P0) und der Anteil übereinstimmender Ergebnisse, die dem Zufall zuzuschreiben sind (Pc), wurden aus der Anzahl der Paare jeder Kategorie, na, nb, nc und nd, berechnet.

Wobei N die Gesamtzahl der Paare ist. Cohens Kappa (\(\kappa\)) ist dann wie folgt definiert:

Das Ergebnis ist eine Zahl zwischen −1 und 1, ein \(\kappa\) von 1 stellt eine perfekte Übereinstimmung zwischen zwei Listen dar, während 0 oder weniger eine Übereinstimmung darstellt, die nicht über das hinausgeht, was der Zufall ergeben würde. [0;0,2[ zeigt eine sehr schwache Übereinstimmung an, [0,2;0,4[ eine schwache Übereinstimmung, [0,4;0,6[ eine mäßige Übereinstimmung, [0,6;0,8[ eine hohe Übereinstimmung, [0,8;1[ eine sehr hohe Übereinstimmung.

Diese Konkordanzanalysen wurden mit R 4.1 (R Foundation for Statistical Computing; Österreich, Wien, 2021) durchgeführt.

Die Norm ISO 15189:2012 legt Qualitäts- und Kompetenzanforderungen in medizinischen Laboren fest32. Es wird von nationalen Akkreditierungsstellen verwendet, um die Kompetenz eines medizinischen Labors für eine bestimmte Methode zu bewerten, anzuerkennen und zu bestätigen. Diese Norm erfordert die Validierung aller nicht standardisierten Analysemethoden, um deren Leistung und spezifische Anforderungen für den vorgesehenen Verwendungszweck zu bestätigen. Die Leistungsmerkmale, die mit einer qualitativen Methode bewertet werden sollten, sind:

Unsicherheit durch Bewertung des Einflusses externer Faktoren auf das Ergebnis. Wir haben die 5M-Methode, auch Ishikawa-Diagramm genannt, verwendet, um zu zeigen, dass externe Faktoren keinen Einfluss auf das Ergebnis unserer Analysen haben. Diese Methode wird häufig in der Molekularbiologie eingesetzt und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bewertung von Risikofaktoren in der Arzneimittelherstellung33. Es erleichtert die systematische Bewertung von Eingabefaktoren, die sich möglicherweise auf die Methodenleistung auswirken33,34.

Spezifität, indem überprüft wird, ob die NGS-Werte für SARS-CoV-2-PCR-negative Proben nicht mit dem SARS-CoV-2-Genom übereinstimmen.

Genauigkeit durch Teilnahme an externen Qualitätsbewertungsrunden (EQA): Wir müssen eine 100-prozentige Übereinstimmung bei den Tippergebnissen erreichen.

Reproduzierbarkeit durch Vergleich der identifizierten Nukleotidmutationen für mindestens drei Proben in drei unabhängigen Sequenzierungsläufen: Wir müssen eine 100-prozentige Übereinstimmung für die Typisierungsergebnisse und \(\kappa\) > 0,81 für die SNV-Identifizierung erreichen.

Wiederholbarkeit durch Vergleich der identifizierten Nukleinsäuremutationen für mindestens drei Proben, die innerhalb desselben Sequenzierungslaufs dreimal sequenziert wurden: Wir müssen eine 100-prozentige Übereinstimmung für die Typisierungsergebnisse und \(\kappa\) > 0,81 für die SNV-Identifizierung erreichen.

Die Akzeptanzschwellen für jedes Merkmal sind in unserem internen Verfahren zur Validierung molekularbiologischer Methoden beschrieben, das von der belgischen Akkreditierungsstelle (BELAC) akkreditiert ist.

Gemäß dem am 30. Dezember 2008 im „Moniteur belge“ auf Seite 68774 veröffentlichten belgischen Gesetz über die Sammlung und Verwendung von menschlichem Material für humanmedizinische Anwendungen oder wissenschaftliche Forschung ist für die Verwendung diagnostischer Restproben keine Einwilligung des Patienten oder eine Genehmigung der Ethikkommission erforderlich für nichtmedizinische Forschung (Titel II; Kap. 1; Art. 3; §5).

In dieser Studie haben wir drei Amplikon-basierte SARS-CoV-2-Genomsequenzierungs-SOPs validiert und verglichen. Im Rahmen dieser Validierungen wurden 55 positiv auf SARS-CoV-2 getestete Proben mit drei Sequenzierungs-SOPs sequenziert: Artic v3, Midnight v1 und Nimagen. Im Rahmen der Akkreditierung nach den ISO15189-Standards haben wir die Unsicherheit jeder Methode mithilfe des 5M-Diagramms und die Spezifität durch Sequenzierung von drei Proben aus Nasopharyngealabstrichen bewertet, die negativ auf SARS-CoV-2 getestet wurden. Zwei Proben waren Teil eines externen Qualitätsbewertungsgremiums und wurden zur Beurteilung der Genauigkeit der Methoden herangezogen. Sieben Proben wurden in drei unabhängigen Sequenzierungsläufen und dreimal in denselben Sequenzierungsläufen für jede SOP sequenziert, um die Reproduzierbarkeit bzw. Wiederholbarkeit der Methoden zu bewerten.

Schließlich wurden die Typisierungsergebnisse und die SNV-Identifizierung zwischen den einzelnen SOPs verglichen.

Wir haben die Unsicherheit der SOPs anhand eines 5M-Diagramms (Messung/Medium, Material, Maschine, Methode, Manpower) bewertet (Ergänzungstabelle 1).

Die Umgebung (Management/Medium) unterliegt überwachten Temperaturbedingungen. Räume verfügen über spezielle Funktionen und Werkbänke werden vor und nach jeder Manipulation mit DNA-Erase-Dekontaminationslösung (MP Biomedicals; Irvine, CA) gereinigt, wie im Abschnitt „Management/Medium“ der Ergänzungstabelle 1 beschrieben, um das Risiko einer Kreuzkontamination zu verringern . Dennoch erhöht die Verwendung von amplifiziertem Material sowie die große Größe der Probenchargen das Risiko einer Kreuzkontamination35. Zu jedem Sequenzierungslauf ab dem Reverse-Transkriptionsschritt wurde eine Negativkontrolle (nukleasefreies Wasser) hinzugefügt, um eine mögliche Kreuzkontamination zu beurteilen. Es zeigte sich, dass bei Messwerten mit weniger als 5 % Schadstoffen keine Abweichungen bei der Eingabe oder dem SNV-Aufruf beobachtet wurden23. Wir haben diese Experimente in silico reproduziert und die Schlussfolgerungen von Freed et al. bestätigt. (Daten nicht angezeigt). Die Anzahl der in unseren Negativkontrollen erhaltenen Messwerte stellt weniger als 2,5 % der Gesamtzahl der für die Probe mit der niedrigsten Anzahl von Messwerten in jedem Lauf erhaltenen Messwerte dar (Artic v3: 1,68 % ± 0,011, Midnight v1: 1,90 % ± 0,0035, Nimagen: 2,04 % ± 0,0031). Wir können daraus schließen, dass die drei SOPs ausreichend streng sind, um technische Kreuzkontaminationen auf ein Maß zu reduzieren, das keinen Einfluss auf die Ergebnisse hat.

Die Reagenzienchargen werden für jeden Lauf dokumentiert und die Sicherheitsdatenblätter für jedes Reagenz (Material) sind verfügbar. Die Geräte durchlaufen tägliche, vierteljährliche und/oder jährliche Wartungsverfahren und die Software wird nach jedem größeren Update (Maschine) validiert. Die Ergebnisse durchlaufen die im Abschnitt „Material und Methoden“ beschriebenen Validierungskriterien, bevor sie technisch und medizinisch validiert werden. Die Verfahren werden alle zwei Jahre überarbeitet (Methode). Das Personal ist geschult, qualifiziert, kennt die Verfahren und wird jährlich bewertet (Manpower) (Ergänzungstabelle 1).

Wir haben die Spezifität der drei SOPs bewertet, indem wir drei SARS-CoV-2-PCR-negative Proben in drei unabhängigen Läufen von der Extraktion bis zum Sequenzierungsschritt einbezogen haben. Obwohl diese Proben eine hohe Anzahl von Lesevorgängen erzeugten, bis zu 68.000 Lesevorgänge, stimmen weniger als zehn Lesevorgänge pro Probe mit dem SARS-CoV-2-Genom überein (Daten nicht gezeigt). Dies weist darauf hin, dass die drei SOPs hochspezifisch für die Sequenzierung und Analyse von SARS-CoV-2 sind.

Um die Genauigkeit der drei SOPs zu beurteilen, haben wir zwei Proben (UZL_CV10_07 und UZL_CV10_89) verwendet, die im November 2021 im Rahmen eines externen Qualitätsbewertungsgremiums (EQA) eingegangen sind, das vom belgischen Nationalen Referenzzentrum (NRC) für Atemwegsviren als Ring organisiert wurde prüfen. Ursprünglich in unabhängigen Laboren sequenzierte Proben wurden vom NRC zentralisiert, das Typisierungsergebnis bestätigt und die Proben an zwei andere unabhängige Labore versandt. Daher verglichen wir unsere Ergebnisse mit denen des Ursprungslabors und eines anderen Labors für beide Proben. Der Vergleich wurde auf zwei Ebenen durchgeführt: Typisierung gemäß WHO-Richtlinien und zwei Datenbanken (Pangolin31 und Nextclade30) und Vergleich von Aminosäuremutationen. Die Typisierungsergebnisse sind für die Probe UZL_CV10_07 in unserem Labor und in beiden Laboren, mit denen sie für die drei Nomenklaturen verglichen wurde, identisch (Tabelle 1), während die Mutation I2230T nur von einem unabhängigen Labor und unserem anhand der drei SOPs identifiziert wurde (Daten nicht gezeigt). . Die Typisierungsergebnisse für die Probe UZL_CV10_89 sind in unserem Labor und in beiden Laboren, mit denen sie verglichen wurde, bei Verwendung von Nextclade oder gemäß den WHO-Richtlinien identisch, unterscheiden sich jedoch von Labor zu Labor durch die Verwendung der Pangolin-Datenbank (Tabelle 1). Diese Diskrepanzen sind auf die Verwendung einer neuen Version der Pangolin-Datenbank in unserem Labor zurückzuführen. Tatsächlich wurden die Typisierungsergebnisse beider externer Labore unter Verwendung von Pangolin v3.1.16, Abstammungslinienversion 2021-11-25, veröffentlicht, die die Abstammungslinie AY.126 noch nicht enthielt. Obwohl bei der Analyse der von den einzelnen Laboren beschriebenen Aminosäuremutationen viele Diskrepanzen beobachtet wurden (Daten nicht gezeigt), hatten diese keinen Einfluss auf die Typisierungsergebnisse. Die drei SOPs zeigten eine Erfolgsquote von 100 %. Die korrekte Identifizierung aller EQA-Proben in unserem Labor wurde vom NRC bestätigt. Seitdem haben wir erfolgreich an drei weiteren vom NRC organisierten Ringtests teilgenommen.

Wir haben die Reproduzierbarkeit der drei SOPs bewertet, indem wir sieben Proben in drei unabhängigen Läufen sequenziert haben. Die Reproduzierbarkeit wurde auf drei Ebenen bewertet: Typisierung gemäß WHO-Richtlinien und zwei Datenbanken (Pangolin und Nextclade), Aminosäuremutationen (aa) und SNV-Identifizierung.

Bezüglich der Typisierung von Proben mit ausreichender Abdeckung erreichte die Übereinstimmung der drei Nomenklaturen mit den drei SOPs 100 % (Ergänzungstabelle 2). Probe CV2031641758, die einen qPCR-Ct-Wert = 29,01 hatte, konnte aufgrund der sehr geringen Abdeckung (Lauf 1: mittlere Abdeckung = 0x, 0 % > 100x, Lauf 2: mittlere Abdeckung) in keiner der für die Midnight SOP verwendeten Datenbanken eingegeben werden = 0x, 0 % > 100x, Lauf 3: mittlere Abdeckung = 5x, 1,5 % > 100x).

Die Konkordanz auf der Ebene der AA-Mutation wurde mithilfe des Cohen-Kappa-Koeffizienten bewertet. Dieser Koeffizient (\(\kappa\)) stellt die Zuverlässigkeit zwischen zwei qualitativen Maßen dar, indem er die Wahrscheinlichkeit berücksichtigt, dass die Übereinstimmung zufällig eintritt. Jede SOP hatte eine sehr hohe Reproduzierbarkeit für die Identifizierung von AA-Mutationen für Proben mit qPCR-Ct-Werten <25 (Artic v3: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9883 ± 0,01011, Midnight v1: Mittelwert \(\kappa\) = 1 ± 0, Nimagen: Mittelwert \(\kappa\) = 0,8566 ± 0,03534). Für eine Probe mit einem qPCR-Ct-Wert = 29,01 ist die Reproduzierbarkeit für Nimagen hoch (\(\kappa\) = 0,7599 ± 0,1293), moderat für Artic v3 (\(\kappa\) = 0,4945 ± 0,1014) und sehr schwach für Midnight v1 (\(\kappa\) = 0 ± 0).

Auf der Ebene der Nukleotidmutation ist die Reproduzierbarkeit hoch (\(\kappa\) > 0,8) für alle Proben mit einem qPCR-Ct-Wert < 25 (Artic v3: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9918 ± 0,01060, Midnight v1: Mittelwert \(\kappa\) = 1 ± 0, Nimagen: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9433 ± 0,1468). Für die Probe mit dem höchsten qPCR-Ct-Wert (Ct = 29,01) sind die Koeffizienten niedriger (Artic v3: \(\kappa\) = 0,6896 ± 0,02007, Midnight v1: \(\kappa\) = 0 ± 0,00005, Nimagen: \ (\kappa\) = 0,7659 ± 0,05119), was auf eine größere Diskrepanz hinweist, insbesondere für die Midnight v1 SOP. Beide Short-Amplicon-Methoden (Artic v3 und Nimagen) weisen einen Koeffizienten auf, der auf eine hohe Korrelation hinweist (Abb. 1, linkes Feld). Obwohl die Reproduzierbarkeit der drei Methoden für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert <25 ähnlich ist, unterscheidet sich die Reproduzierbarkeit der Midnight v1 SOP deutlich von der der beiden anderen Methoden für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert >25 (Ergänzungstabelle 3).

Entwicklung des Cohen-Kappa-Koeffizienten der Reproduzierbarkeit (linkes Feld) und der Wiederholbarkeit (rechtes Feld) für jede Probe in Abhängigkeit vom Ct-Wert für das N-Gen und für jede Methode: Artic v3 (rot), Midnight v1 (grün) und Nimagen (Blau). Ein Kappa-Koeffizient von 1 bedeutet eine perfekte Übereinstimmung zwischen drei unabhängigen Läufen (linkes Feld) oder zwischen drei Wiederholungen im selben Lauf (rechtes Feld), während ein Kappa-Koeffizient von 0 als Übereinstimmung interpretiert werden kann, die nicht über das hinausgeht, was der Zufall ergeben würde. Die drei Methoden haben einen hohen Kappa-Koeffizienten für die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit für alle Proben mit einem Ct-Wert <25, dieser Koeffizient nimmt jedoch für Proben über diesem Schwellenwert ab.

Wir haben die Wiederholbarkeit jeder SOP bewertet, indem wir sieben Proben dreimal in einem einzigen Lauf sequenziert haben. Die Wiederholbarkeit wurde auf drei Ebenen bewertet: Typisierung gemäß WHO-Richtlinien und zwei Datenbanken (PangoLineage und Nextclade), AA-Mutationen und SNV-Identifizierung.

Alle Typisierungsergebnisse stimmten für jede mit den drei SOPs verarbeitete Probe überein, mit Ausnahme der Probe CV2031641758, die den höheren qPCR-Ct-Wert (29,01) aufweist und aufgrund der geringen Abdeckung nicht mit der Mitternachts-SOP typisiert werden konnte (Wiederholung 1: mittlere Abdeckung = 1x, 0 % > 100x, Wiederholung 2: mittlere Abdeckung = 0x, 0 % > 100x, Wiederholung 3: mittlere Abdeckung = 1x, 0 % > 100x) (Ergänzungstabelle 4).

Die zur Bewertung der Konkordanz für AA-Mutationen durchgeführte statistische Kappa-Analyse zeigte die sehr hohe Wiederholbarkeit aller SOPs für Proben mit qPCR-Ct-Werten < 25 (Artic v3: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9953 ± 0,00402, Midnight v1: Mittelwert \ (\kappa\) = 1 ± 0, Nimagen: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9435 ± 0,02546), aber der \(\kappa\)-Koeffizient nahm für eine Probe mit einem qPCR-Ct-Wert > 25 ab (Artic v3: \(\kappa \) = 0,7279 ± 0,08269, Midnight v1: \(\kappa\) = 0 ± 0, Nimagen: \(\kappa\) = 0,8837 ± 0,03753) zeigt immer noch eine hohe Wiederholbarkeit für Nimagen und Artic, während Midnight v1 nicht wiederholbar ist.

Die Ergebnisse für Nukleotidmutationen waren ähnlich: Die Wiederholbarkeit war für Proben mit qPCR-Ct-Wert < 25 sehr hoch (Artic v3: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9961 ± 0,002926, Midnight v1: Mittelwert \(\kappa\) = 1 ± 0, Nimagen: Mittelwert \(\kappa\) = 0,9742 ± 0,01683), aber der Kappa-Koeffizient war für die Probe mit einem Ct-Wert >25 niedriger (Artic v3: \(\kappa\) = 0,7581 ± 0,01951, Nimagen: \( \kappa\) = 0,8287 ± 0,01903), insbesondere für die Midnight v1 SOP, die einen \(\kappa\)-Koeffizient = 0 ± 0,00003 hatte, was darauf hinweist, dass sie für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert > 25 nicht wiederholbar war (Abb. 1). rechtes Feld). Dies lag an der geringen Lesetiefe (<20) an den meisten Nukleotidpositionen für zwei Wiederholungen, die mit der Midnight v1 SOP durchgeführt wurden. Da es sich bei dieser Tiefe um den in der Bioinformatik-Pipeline festgelegten Mindestschwellenwert für das Aufrufen von Nukleotiden in der Konsensussequenz handelte und da die dritte Wiederholung an diesen Positionen eine ausreichende Lesetiefe aufwies, ergab die Analyse eine vollständige Nichtübereinstimmung. Obwohl sich die Wiederholbarkeit zwischen den drei Methoden für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert <25 nicht wesentlich unterscheidet, unterscheidet sich die Wiederholbarkeit der Midnight v1 SOP im Vergleich zu den beiden anderen Methoden für einen qPCR-Ct-Wert >25 deutlich (Ergänzungstabelle 3).

Die drei in diesem Dokument beschriebenen SOPs erfüllten das ISO15189-Validierungskriterium für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert < 25, dem empfohlenen Ausschlusskriterium für Analysen im klinischen Umfeld. Obwohl die drei Methoden nicht leistungsstark genug waren, um Proben mit einem qPCR-Ct-Wert > 25 im klinischen Umfeld zu analysieren, können Sequenzierungsergebnisse und Stammtypisierung im nichtklinischen Umfeld erhalten werden, sollten jedoch mit Vorsicht interpretiert werden. Daher haben wir die drei Methoden anhand von 55 Proben verglichen, ohne die Ausschlusskriterien für den Ct-Wert zu berücksichtigen.

Die Proben wurden gemäß den drei SOPs sequenziert und auf zwei Ebenen verglichen: Typisierung gemäß WHO-Richtlinien und zwei Datenbanken (Pangolin und Nextclade) sowie SNV-Identifizierung.

Für 45 von 55 Proben mit gültigen Typisierungsergebnissen, einschließlich 27 der 29 Proben mit einem qPCR-Ct-Wert < 25, zeigen die WHO- und NextClade-Nomenklaturen eine 100-prozentige Übereinstimmung zwischen den drei Methoden. Bei Pangolin, einer strengeren Typisierungsmethode, beobachteten wir fünf Abweichungen zwischen den SOPs. Unter diesen identifizierte Pangolineage eine Variante, die direkt vom nächsten Vorfahren stammt, der für die anderen SOPs identifiziert wurde. Wir haben diese Abweichungen eher als Ungenauigkeiten denn als tatsächliche Abweichungen eingestuft. Alle Proben, die diese Ungenauigkeiten aufwiesen, hatten einen qPCR-Ct-Wert >30 für das N-Gen (Tabelle 2).

Zehn mit der Midnight v1 SOP sequenzierte Proben konnten aufgrund unzureichender Abdeckung in keine Nomenklatur eingegeben werden. Davon konnten drei mit der Artic SOP sequenzierte Proben bzw. zwei mit der Nimagen SOP sequenzierte Proben ebenfalls nicht typisiert werden. Acht dieser zehn Proben hatten einen N-Gen-qPCR-Ct-Wert von >25 (Tabelle 2), was uns dazu veranlasste, die Entwicklung der Genomabdeckung als Funktion der Viruslast zu untersuchen. Wir haben beobachtet, dass bei den drei SOPs die Abdeckung für alle Proben mit einem N-Gen-qPCR-Ct-Wert <25 hoch war (96 % und 90 % der Proben hatten eine mittlere Abdeckung über 380x für die Methoden Artic v3 bzw. Midnight v1) und 90 % der Proben haben eine mittlere Abdeckung über 600\(\times\) für die Nimagen-Methode), aber die Sequenzierungsabdeckung sank drastisch mit den drei SOPs für Proben mit einem qPCR-Ct-Wert >25 (Abb. 2).

Entwicklung der mittleren Genomabdeckung entsprechend dem Ct-Wert für das N-Gen für die drei Methoden: Artic v3 (rot), Midnight v1 (grün) und Nimagen (blau). Die mittlere Abdeckung ist für alle Proben mit einem Ct-Wert <25 relativ konstant und sinkt für Proben mit einem Ct-Wert >25.

Anschließend verglichen wir die in jeder Stichprobe identifizierten SNVs für eine SOP mit der anderen unter Verwendung des Cohen-Kappa-Koeffizienten. Proben mit einem qPCR-Ct-Wert <25 hatten Kappa-Koeffizienten nahe oder gleich 1, was auf eine hohe Übereinstimmung zwischen beiden verglichenen Methoden hinweist. Bei Proben mit einem Ct-Wert >25 nahm der Kappa-Koeffizient mit zunehmendem Ct-Wert zunehmend ab. Dieser Rückgang war ähnlich, wenn alle Methoden miteinander verglichen wurden (Abb. 3). Alle beobachteten Fehlpaarungen können jedoch durch eine zu geringe Lesetiefe an der Position der Fehlpaarung für die Methode erklärt werden, die die Mutation nicht identifizierte (<20 Lesevorgänge für die Nanopore-Methoden oder <5 Lesevorgänge für die Illumina-Methode). Wenn an dieser genomischen Position die Lesetiefe größer als 0, aber unter den zuvor genannten Grenzwerten war, beobachteten wir, dass die Mutation in mehr als 70 % der Lesevorgänge vorhanden war, was darauf hindeutet, dass die Diskrepanzen nicht auf Sequenzierungsfehler zurückzuführen waren Es liegt an den Methoden, sondern an den Nachweisschwellen, die in den Bioinformatik-Pipelines festgelegt sind.

Entwicklung des Kappa-Koeffizienten von Cohen für den Vergleich von SNVs-Aufrufen von drei Methoden: Artic v3, Midnight v1 und Nimagen, jeweils zwei Mal verglichen, abhängig vom Ct-Wert für das N-Gen jeder Probe. Ein Kappa-Koeffizient von 1 bedeutet eine perfekte Übereinstimmung, während ein Kappa-Koeffizient von 0 eine vollständige Nichtübereinstimmung bedeutet. Die drei Methoden rufen nahezu identische SNVs für Proben mit einem Ct-Wert <25 (Kappa-Koeffizient nahe 1) auf, die SNVs-Aufrufe unterscheiden sich jedoch immer mehr, je höher der Ct-Wert ist. Die blaue Linie ist eine geglättete Kurve, die auf dem lokal schätzenden Streudiagramm-Glättungsalgorithmus basiert, und der graue Bereich stellt das 95 %-Konfidenzband dar.

Die drei in diesem Artikel untersuchten SOPs stellten Standardverfahren zur Vorbereitung von NGS-Bibliotheken dar. In unseren Händen und um optimale Ergebnisse zu erzielen, ermöglichten beide ONT-Methoden die Sequenzierung von 48 Proben mit einer 9,4-Durchflusszelle und einem GridION (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) in einem Durchgang, während die Illumina-Methode die Sequenzierung von 20 Proben ermöglichte. vier Proben mit einer iSeq 100 i1 Reagent v2-Kartusche (Illumina; CA, USA) in einem Lauf. Der Durchlauf, von der umgekehrten Transkription bis zum Erwerb von Fastq-Dateien, erforderte 32 Stunden, einschließlich 3:30 Stunden praktischer Zeit, mit der Artic v3-SOP, 29 Stunden, einschließlich 1:30 Uhr praktischer Zeit, für die Midnight v1-SOP und 29:30 Stunden, einschließlich 2:30 Stunden praktischer Zeit -Zeit für die Niimagen SOP. Es ist erwähnenswert, dass die Sequenzierungszeit für beide SOPs mithilfe der Nanopore-Technologie weiter verkürzt werden könnte. Die Sequenzierungskosten einer Probe, basierend auf den Katalogpreisen, ohne Berücksichtigung von Extraktions- und Kunststoffverbrauchsmaterialien, sind für Midnight v1 SOP am niedrigsten und für Nimagen SOP am höchsten. Die Sequenzierungskosten könnten für die ONT-Verfahren weiter gesenkt werden, da diese Technologie die Wiederverwendung von Sequenzierungsflusszellen ermöglicht. Jede Änderung oder Optimierung eines der Verfahren erfordert mindestens eine erneute Verifizierung der Methode.

Die Bioinformatik-Pipelines wurden vor ihrer Implementierung in den Analyseablauf verifiziert, indem drei unabhängige Analysen der nach der Sequenzierung zweier Proben gewonnenen Rohdaten durchgeführt wurden. Mit den Datenbanken Nextclade und Pangolin wurde eine 100-prozentige Übereinstimmung der Typisierung erreicht. Nach ihrer Implementierung führte jedes größere Update einer der an den Pipelines beteiligten Software zu einem erneuten Validierungsverfahren, das aus der Neusequenzierung von fünf Proben bestand, für die bereits mit der neuesten Version der Software analysierte Daten verfügbar waren. Es muss eine 100 %ige Typisierungsübereinstimmung mit den vorherigen Typisierungsergebnissen (WHO, Nextclade und Pangolin) erreicht werden. Alle Aktualisierungen und Validierungsberichte wurden im Qualitätsmanagementsystem des Labors protokolliert.

Die drei in dieser Studie bewerteten Methoden wurden für Proben mit einem N-Gen-qPCR-Ct-Wert <25 validiert und erfüllten die ISO15189-Anforderungen. Sie generierten reproduzierbare, wiederholbare und genaue Daten für die Sequenzierung des gesamten Genoms klinischer SARS-CoV-2-Proben. Die Fähigkeit, SARS-CoV-2-Varianten nach unterschiedlichen Nomenklaturen zu identifizieren, war unabhängig von der Methode identisch. Die Eingabe mit der Pangolin-Datenbank könnte zu geringfügigen Abweichungen führen, die hauptsächlich auf die unterschiedlichen Versionen der verwendeten Datenbank zurückzuführen sind und nicht auf einen technischen Fehler während der Sequenzierungsverfahren selbst zurückzuführen sind. Ein weiterer Faktor, der die Tippgenauigkeit beeinflusste, war die Abdeckung. Wie bereits in der Literatur beschrieben, bestätigten unsere Daten, dass die Abdeckung bei Amplikon-basierten Sequenzierungsmethoden empfindlich auf die Viruslast reagierte, wobei letztere mit dem qPCR-Ct-Wert korrelierte36,37. Proben mit einem qPCR-Ct-Wert >25 zeigten in der Regel eine unzureichende Lesetiefe, was zu einer geringen Zuverlässigkeit einiger Schlüsselmutationen führte, was zu einer falschen oder ungefähren Abstammungsbezeichnung führen konnte, was die Bedeutung von Probenauswahlkriterien im Kontext nationaler Überwachungsprogramme mit klinischen Proben unterstreicht8, 38. Unsere Daten bestätigten, dass die drei hier validierten Methoden ähnlich hochwertige Ergebnisse lieferten und für die epidemiologische Überwachung von SARS-CoV-2 unter Verwendung von Proben mit einem N-Gen-qPCR-CT-Wert <25 im klinischen Umfeld geeignet waren.

Für die Bestimmung der klonalen Verwandtschaft bei Ausbruchsuntersuchungen, die den genauen Nachweis einzelner Nukleotidvarianten (SNVs) erfordern, legen unsere Ergebnisse nahe, dass alle drei Methoden bei der Analyse von Proben mit hoher Viruslast (qPCR-Ct-Wert <25) verwendet werden könnten. Unsere Daten zeigten jedoch, dass für Proben mit geringer Viruslast (qPCR-Ct-Wert >25) eine Methode mit kleineren Amplifikaten (Artic v3 und Nimagen) bevorzugt werden sollte, da diese eine bessere Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit sowie eine höhere mittlere Abdeckung des Genoms aufweisen . Diese Variabilität der Abdeckung für Proben mit geringer Viruslast wurde bereits von Freed et al. berichtet. Dennoch haben sie gezeigt, dass es möglich war, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen, indem mehr Sequenzierungsdaten als bei Proben mit hoher oder mittlerer Viruslast generiert wurden. Dies wurde in unserer Studie nicht erreicht, da wir alle Proben unter den gleichen Bedingungen sequenziert haben. Es hat sich auch gezeigt, dass das für die Reverse Transkription verwendete Material mindestens 1.000 Kopien viraler RNA enthalten sollte, um SNVs effektiv zu erkennen und damit eine Mindestabdeckung von 400x mit einer Amplikon-basierten NGS-Technik zu erreichen39,40.

Alle drei in diesem Artikel beschriebenen Methoden sind Amplikon-basierte Methoden. Sie ermöglichten effizient die Anreicherung von Zielsequenzen, um optimale Ergebnisse für ein breites Spektrum an Proben zu erzielen. Sie reagierten jedoch empfindlich auf Substitutionen, Deletionen und Insertionen in der Sequenz, mit der die Primer hybridisierten. Da RNA-Viren, einschließlich SARS-CoV-2, regelmäßig solche Ereignisse in ihrem Genom aufweisen10, ist es wichtig, Aussetzer bestimmter Amplifikate zu identifizieren und die in den SOPs verwendeten Primer regelmäßig an die Entwicklung des Virus anzupassen. Bei der Amplifikationsmethode „Midnight v1“ wurde eine geringere Anzahl an Primern verwendet, wodurch sie weniger empfindlich gegenüber Aussetzern ist. Sollte es dennoch zu Aussetzern kommen, wird der nicht mehr abgedeckte Bereich mit dem Midnight v1 SOP deutlich größer sein als mit den Artic- oder Nimagen-SOPs. Das Primerdesign der drei SOPs ermöglicht jedoch die Amplifikation überlappender Fragmente (ergänzende Abbildung 1) und ermöglicht so die schnelle Identifizierung einer Mutation in der komplementären Sequenz eines Primers mithilfe von Open-Access-Tools wie Integrative Genomics Viewer41.

In mehreren Ländern, darunter Belgien, wurden vorübergehend stammspezifische PCRs (oder VOC-PCR) zur schnellen und kostengünstigen Überwachung von VOCs eingeführt, beispielsweise während der Entstehung der Alpha- und Omicron-BA.1-Varianten, die durch ein S-Gen-Ziel gekennzeichnet waren Fehler durch PCR-Kits erkennbar42. Diese PCR-Mutationsmarker stießen schnell an ihre Grenzen, da sie unter der hohen Mutationsrate des Virus litten und daher eine zu häufige Aktualisierung der PCR-Primer erforderten, so dass NGS die Goldstandardtechnik für den Nachweis und die Überwachung von VOCs in Überwachungsprogrammen darstellte. In diesem Zusammenhang sollte die Midnight-v1-Methode trotz ihrer schlechteren Sequenzierungsqualität für Proben mit geringer Viruslast nicht vernachlässigt werden. Das technische Protokoll ist im Vergleich zu den beiden anderen hier vorgestellten Methoden, die für das technische Personal sehr zeitaufwändig und mühsam sind, sehr einfach und schnell einzurichten. Es ist außerdem kostengünstiger und kann daher die ideale Methode für eine groß angelegte Überwachung sein, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen.

Im Jahr 2028 müssen alle europäischen Diagnoselabore die neue europäische Verordnung für Medizinprodukte und In-vitro-Diagnostika einhalten, die 2022 in Kraft trat und darauf abzielt, weitere klinische Analysen zu standardisieren und die Patientensicherheit zu erhöhen17,18. Eine Hauptanforderung der IVDR besteht darin, dass alle im Labor entwickelten Tests (z. B. NGS-Typisierungsmethoden für neu auftretende und sich schnell ausbreitende Krankheitserreger) von einer nationalen Akkreditierungsstelle akkreditiert werden müssen, was eine vollständige Validierung der Methode zur Erfüllung der ISO15189-Standards19 erfordert. Diese Studie ist ein erster Schritt zur Umsetzung der IVDR. Dennoch könnte dieser Wettlauf um Standardisierung und Sicherheit die Fähigkeit medizinischer Labore beeinträchtigen, modernste Diagnostik bereitzustellen. In der molekularen Mikrobiologie erfordert die Typisierung sich schnell entwickelnder Viren während einer Epidemie oder Pandemie Flexibilität wie die Anpassung von Primersätzen für Amplikon-basierte Methoden oder die regelmäßige Aktualisierung von Typisierungsdatenbanken. In der molekularen Pathologie erfordern die ständige Weiterentwicklung der medizinischen Praxis und das wachsende Wissen über die Tumorentwicklung und den Erwerb von Resistenzen gegen Behandlungen eine regelmäßige Aktualisierung der DNA-Mutations- und RNA-Fusions-Panels, damit Patienten schnell von den neuesten Erkenntnissen auf diesem Gebiet profitieren können. Jede größere Änderung an einem validierten Verfahren (z. B. Reagenzzusammensetzung, Softwareversion, Datenbank), die eine neue vollständige Validierung und die Einhaltung der IVDR mit sich bringt, wird für medizinische Labore, die bereit sind, an der Spitze ihrer Praxis zu bleiben, eine große Herausforderung, zeitaufwändig und kostspielig sein .

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die drei in diesem Dokument vorgestellten Methoden in unseren Händen alle Anforderungen des ISO15189-Standards für die Etablierung einer epidemiologischen Typisierungsmethode im klinischen Umfeld erfüllten und mit gleichem Vertrauen im Rahmen von SARS-CoV-2 eingesetzt werden können Überwachungsprogramme. Bei der Arbeit mit Proben mit geringer Viruslast sollten jedoch Methoden mit kürzeren Amplifikaten bevorzugt werden. Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die einen vollständigen Validierungsprozess für SARS-CoV-2-Genomsequenzierungs-SOPs vorschlägt, der den ISO15189-Standards entspricht und zur Akkreditierung der Methoden durch eine nationale Akkreditierungsstelle führt, ein erster Schritt in diese Richtung IVDR-Implementierung im klinischen Umfeld.

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind im BioSample-Repository unter der Zugangsnummer PRJNA954542 verfügbar. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/954542.

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Die Autoren danken Ph. Biol. Jean-Louis Bayart von den Cliniques Saint Pierre Ottignies für die Bereitstellung einiger klinischer Proben. Die Autoren danken Dr. Edith Renguet für ihre Hilfe bei der Verbesserung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Pierre Bogaerts und Jonathan Degosserie.

Abteilung für Labormedizin, UCLouvain, CHU UCL Namur, 5530, Yvoir, Belgien

Céline Maschietto, Gaëtan Otto, Pauline Rouzé, Nicolas Debortoli, Lesly Nyinkeu, Olivier Denis, Te-Din Huang, François Mullier, Pierre Bogaerts und Jonathan Degosserie

COVID-19 Federal Testing Platform Bis, CHU UCL Namur & UNamur, 5530, Yvoir, Belgien

Céline Maschietto, Gaëtan Otto, Lesly Nyinkeu, Olivier Denis, Te-Din Huang, François Mullier und Jonathan Degosserie

Labor für Mikrobiologie, CHU UCL Namur, 5530, Yvoir, Belgien

Pauline Rouzé, Olivier Denis, Te-Din Huang und Pierre Bogaerts

Namur Molecular Tech, CHU UCL Namur, 5530, Yvoir, Belgien

Nicolas Debortoli, Lesly Nyinkeu und Jonathan Degosserie

Wissenschaftliche Unterstützungseinheit, CHU UCL Namur, 5530, Yvoir, Belgien

Benoît Bihin

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CM, GO, PB und JD konzipierten die Experimente, CM, PR und LN führten die Experimente durch, GO entwickelte die Bioinformatik-Pipelines, CM, BB, ND und JD analysierten die Ergebnisse, BB und ND führten statistische Analysen durch, OD und TD. H. validierte die Ergebnisse, JD überwachte das Projekt, CM und JD schrieben das Manuskript, PB und FM überprüften das Manuskript ausführlich, alle Autoren überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Jonathan Degosserie.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Maschietto, C., Otto, G., Rouzé, P. et al. Mindestanforderungen für die ISO15189-Validierung und Akkreditierung von drei Sequenzierungsverfahren der nächsten Generation für die SARS-CoV-2-Überwachung im klinischen Umfeld. Sci Rep 13, 6934 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34088-w

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Eingegangen: 25. Januar 2023

Angenommen: 24. April 2023

Veröffentlicht: 28. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34088-w

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Mindestanforderungen für die ISO15189-Validierung und Akkreditierung von drei Sequenzierungsverfahren der nächsten Generation für SARS