Ein Genom

Nature Genetics Band 55, Seiten 54–65 (2023)Diesen Artikel zitieren

10.000 Zugriffe

4 Zitate

67 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Identifizierung der Gene und Prozesse, die genetische Assoziationssignale für komplexe Krankheiten vermitteln, stellt eine große Herausforderung dar. Da viele der genetischen Signale für Typ-2-Diabetes (T2D) ihre Wirkung durch eine Funktionsstörung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse entfalten, führten wir ein genomweites gepooltes CRISPR-Funktionsverlust-Screening in einer menschlichen Betazelllinie der Bauchspeicheldrüse durch. Wir haben die Regulierung des Insulingehalts als krankheitsrelevante Anzeige der Betazellfunktion bewertet und 580 Gene identifiziert, die diesen Phänotyp beeinflussen. Die Integration mit genetischen und genomischen Daten lieferte experimentelle Unterstützung für 20 mögliche T2D-Effektortranskripte, einschließlich des Autophagierezeptors CALCOCO2. Der Verlust von CALCOCO2 war mit verzerrten Mitochondrien, weniger proinsulinhaltigen unreifen Granula und einer Ansammlung von Autophagosomen bei Hemmung der Autophagie im Spätstadium verbunden. Träger von T2D-assoziierten Varianten am CALCOCO2-Locus zeigten außerdem eine veränderte Insulinsekretion. Unsere Studie zeigt, wie zelluläre Screenings bestehende Multi-Omic-Bemühungen ergänzen können, um das mechanistische Verständnis zu unterstützen und Beweise für kausale Effekte an genomweiten Assoziationsstudienorten zu liefern.

Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben Tausende belastbarer Assoziationen für Typ-2-Diabetes (T2D) und verwandte Merkmale geliefert, die meisten lassen sich jedoch auf nichtkodierende Regionen mit einer wahrscheinlichen regulatorischen Funktion abbilden1. Eine unvollständige Feinkartierung bedeutet, dass die meisten GWAS-Loci nicht einer einzigen kausalen Variante zugeordnet werden, sondern vielmehr mehreren Varianten in einem glaubwürdigen Satz, von denen jede möglicherweise die Genexpression in einem anderen zellulären Kontext beeinflussen könnte. Der typische Schritt nach der Feinkartierung besteht darin, die vermeintlich kausalen Varianten und die regulatorischen Elemente mit den Genen zu verbinden, die sie regulieren, und zwar unter Verwendung von Methoden wie der Kolokalisierung von cis-Expression Quantitative Trait Loci (eQTL), der Kozugänglichkeit von Einzelzell-Chromatin und DNA-Proximity-Assays2,3 ,4,5. Die Einschränkungen dieser Ansätze sind ihre Zelltyp- und Kontextabhängigkeit (in ungeeigneten Zelltypen oder -zuständen durchgeführte Tests können Verbindungen zwischen Varianten und Genen offenbaren, die nicht mit der Krankheitspathogenese zusammenhängen) und die molekulare Pleiotropie (interessante Varianten können die Transkription mehrerer Gene regulieren). cis, wodurch die Identität des kausalen Transkripts verschleiert wird). Diese Ansätze können Hypothesen über potenzielle Effektoren aufstellen, liefern jedoch in der Regel keine endgültigen Beweise.

Störungsstudien können überzeugendere Beweise für die Ursache liefern, jedoch nur, wenn authentische Modelle und krankheitsrelevante Phänotypen verwendet werden6. Der stärkste Beweis ergibt sich aus krankheitsassoziierten Kodierungsvarianten, die Aufschluss über die Folgen von Störungen der Gen- und Proteinfunktion beim Menschen geben, aber die geringe Häufigkeit der meisten dieser Varianten schränkt diesen Ansatz ein2. Menschliche Zellmodelle und CRISPR-basierte Technologien bieten eine attraktive Alternative zur Erstellung genomweiter Profile der phänotypischen Folgen von Genstörungen und zum Verständnis der Krankheitsbiologie6. Im Mittelpunkt dieses Anspruchs steht das Vertrauen in die Krankheitsrelevanz eines Zelltyps. Bei T2D unterstreichen sowohl physiologische als auch epigenomische Erkenntnisse die zentrale Rolle der Pankreasinseln und damit der insulinproduzierenden Betazellen bei der Vermittlung des Krankheitsrisikos3,4,5,6,7. Wesentliche Unterschiede zwischen Nagetier- und menschlichen Insel- oder Betazellen sprechen für die Verwendung von menschlichem Gewebe und Zelllinien8,9,10,11,12,13. Wir und andere haben in diesem wichtigen menschlichen Gewebe große transkriptomische und epigenomische Ressourcen generiert, die eine genomweite Integration genetischer und genomischer Daten ermöglichen, um Kandidaten-Effektortranskripte an T2D-GWAS-Loci4,7,14,15 zu identifizieren. Wir ergänzen diese Ressourcen nun durch ein genomweites CRISPR-Loss-of-Function (LoF)-Screening in der gut charakterisierten menschlichen Pankreas-Beta-Zelllinie EndoC-βH1, um Gene zu identifizieren, die den Insulingehalt regulieren16,17,18. Die immortalisierte EndoC-βH1-Zelllinie weist eine multiomische Signatur auf, die den primären menschlichen Betazellen ähnelt, allerdings mit unterschiedlichen Merkmalen, die den fötalen und transformierten Ursprung der Zelllinie hervorheben18,19. Während der Insulingehalt im Vergleich zu primären Inseln geringer ist, weisen EndoC-βH1-Zellen ähnliche elektrophysiologische und sekretorische Eigenschaften auf, was sie zu einem physiologisch relevanten Modell zur Untersuchung der Betazellfunktion in vitro macht17,20,21,22.

Dieses genomweite CRISPR-Screening in einer menschlichen Betazelllinie liefert zelluläre Beweise für 580 Gene als Regulatoren der Betazellfunktion, unterstützt eine krankheitsrelevante und wahrscheinlich kausale Rolle von 20 Genen an T2D-Loci und identifiziert den Autophagierezeptor CALCOCO2 als Regulator von Funktion menschlicher Betazellen. Wir zeigen, dass Träger von Diabetes-Risiko-Allelen in CALCOCO2 die Insulinsekretion verändert haben und dass der Verlust von CALCOCO2 in menschlichen Betazellen zu einer durch Autophagie vermittelten veränderten Insulingranula-Homöostase führt.

Die durch Glukose stimulierte Insulinsekretion ist das primäre Maß für die Betazellfunktion, stellt jedoch eine ungeeignete phänotypische Anzeige für ein gepooltes Hochdurchsatz-Screening dar, da sezerniertes Insulin nicht mit seiner zellulären Quelle in Verbindung gebracht werden kann. Im Gegensatz zur Insulinsekretion kann der intrazelluläre Insulingehalt jedoch mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) quantifiziert werden. Veränderungen des Insulingehalts wurden auch mit T2D-assoziierten Risikogenen in Verbindung gebracht, beispielsweise am Peptidylglycin-α-amidierenden Monooxygenase (PAM)-Locus, wo T2D-Risikoallele eine verringerte Expression und/oder Funktion verursachen und eine verringerte PAM-Expression mit einem verringerten Insulingehalt verbunden ist für TCF7L2, den Locus, der das stärkste Risiko für T2D vermittelt und ein Hauptregulator der Insulinproduktion mit verringertem Insulingehalt bei Trägern des Risiko-Allels ist23,24,25.

Mithilfe einer FACS-Auslesung haben wir eine gepoolte CRISPR-LoF-Screening-Pipeline in der menschlichen Pankreas-Beta-Zelllinie EndoC-βH1 entworfen, die auf der Einführung von Single-Gen-Knockouts (KOs) über eine lentivirale genomweite CRISPR-Bibliothek basiert (Abb. 1a). Die Zellen wurden in Populationen sortiert, die entweder niedrige oder hohe Mengen an intrazellulärem Insulin enthielten, und stabil integrierte sgRNAs wurden durch Next-Generation-Sequenzierung identifiziert.

a, Pipeline für ein genomweites CRISPR-LoF-Screening in EndoC-βH1 von der Virustransduktion (links) bis zur Antibiotikaauswahl (Mitte) und einer abschließenden FACS-Auswahl, gefolgt von Sequenzierung und Anreicherungsanalyse integrierter sgRNAs (rechts). b,c, FACS-Färbung für intrazelluläres Insulin in INS-stummgeschaltetem EndoC-βH1 (siINS, blau) oder ihren jeweiligen nicht zielgerichteten Kontrollen (siNT, rosa) als einzelne Diagramme (b) oder Histogrammüberlagerung (c). d,e, Die damit verbundene mRNA-Expression von INS (d) und die entsprechenden intrazellulären Insulinspiegel, gemessen durch alphaLISA (e). f,g, FACS-Färbung unter Verwendung des Insulinantikörpers (blau) oder der Isotypkontrolle (rosa) in der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie HEK293T als einzelne Diagramme (f) oder Histogrammüberlagerung (g). h, Pipeline für ein kleines CRISPR-Screening in EndoC-βH1, das neben EV-Kontrollzellen nur auf drei Gene (NMS, INS und PAM) abzielt. FACS-Sortiertore für niedrigen Insulinspiegel (gestrichelte Linie) wurden basierend auf parallel transduzierten Kontrollzellen bestimmt. Die sgRNA-Anreicherung wurde in INSlow im Vergleich zu INShigh bewertet. i,j, FACS-Färbung in EndoC-βH1 im Vergleich zur Insulinfärbung von EV-Kontrollzellen (rosa) und Zellen aus dem kleinen CRISPR-Screen (blau) als einzelne Diagramme (i) oder Überlagerung (j). Die jeweiligen Kästchen kennzeichnen die Sortiertore INSlow und INShigh. k, sgRNA-Anreicherung für alle einzelnen sgRNAs in INSlow im Vergleich zu INShigh aus Kontrollproben (grau) und Positivkontrollen (INS und PAM, lila und rosa). Das Boxplot umfasst die minimalen bis maximalen Werte, während die Mittellinie den Median darstellt. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus zwei (i–k) oder drei unabhängigen Experimenten und repräsentative FACS-Diagramme werden mit ihrer jeweiligen Schalldämpfungseffizienz angezeigt. Die Daten wurden mittels Zwei-Stichproben-t-Test (e) analysiert. Keine grafische Darstellung der Signifikanz deutet auf nichtsignifikante Ergebnisse hin. NT, nicht zielgerichtet. log2(FC), log2(fold change); EV, leerer Vektor; SSC-A, seitlicher Streubereich.

Um sicherzustellen, dass die FACS-basierte Auslesung des Insulingehalts in EndoC-βH1 hochspezifisch und empfindlich war, haben wir einen Antikörper und ein Protokoll ausgewählt, die auf dem Vergleich mehrerer komplementärer Strategien basieren (Extended Data, Abb. 1). Der nahezu vollständige siRNA-basierte Abbau von INS in EndoC-βH1 führte zu zwei Populationen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten, was die Empfindlichkeit bestätigte (Abb. 1b – d). Der Grad der Trennung stimmte mit einer unabhängigen alphaLISA-Quantifizierung des Insulingehalts überein und zeigte etwa 46 % Restprotein (Abb. 1e). Die Spezifität des Antikörpers wurde in der nicht-INS-exprimierenden menschlichen Zelllinie HEK293T bestätigt (Abb. 1f, g). Schließlich wurde das Screening-Protokoll validiert, indem drei Gene in einem kleinen Screening untersucht wurden, darunter die Positivkontrollgene INS und PAM, von denen bekannt ist, dass sie bei Deletion eine Verringerung des Insulingehalts induzieren, und NMS, eine Negativkontrolle, die nicht in EndoC-βH1 exprimiert wird ( Ref. 23) (Abb. 1h). Im Vergleich zu einer leeren Vektor (EV)-Kontrolle, die nur für Cas9 kodiert, zeigten die Zellen ein verringertes INS-FACS-Signal und eine Anreicherung von INS- und PAM-sgRNA innerhalb der INSlow-Population, wohingegen sgRNAs, die auf NMS abzielten, keinen Unterschied zeigten (Abb. 1i – k). In Übereinstimmung mit der zuvor gezeigten schwächeren Wirkung auf den Insulingehalt zeigten sgRNAs, die auf PAM abzielen, eine hochreplizierbare, aber geringere Anreicherung im Vergleich zu sgRNAs, die auf INS abzielten, was die Eignung der Pipeline für ein genomweites Screening bestätigt23.

Wir führten zwei unabhängige genomweite Screen-Replikationen in der menschlichen Beta-Zelllinie EndoC-βH1 durch, wobei wir die CRISPR-Bibliothek Toronto KnockOut Version 3.0 (TKOv3) verwendeten, die auf 18053 proteinkodierende menschliche Gene mit vier sgRNAs pro Gen abzielte26. Pro Replikat wurden mindestens 670 Millionen Zellen bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität (MOI) mit einer Abdeckung von etwa 500 Zellen pro sgRNA lentiviral transduziert (Abb. 1a). Im Vergleich zu den Kontrollen zeigten die Screening-Zellen eine breitere Insulinsignalverteilung im FACS, insbesondere in Richtung niedrigerer Insulinwerte, was auf einen veränderten Insulingehalt aufgrund von CRISPR-KO-vermittelten Effekten hinweist (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 2). Es wurden zwei Zellpopulationen gesammelt, solche mit niedrigem (INSlow) und solche mit hohem Insulingehalt (INShigh), gefolgt von sgRNA-Amplifikation und -Sequenzierung (Extended Data Abb. 3). Wir haben den MAGeCK-Algorithmus verwendet, um die sgRNA-Häufigkeit zu vergleichen und sgRNAs zu identifizieren, die in INSlow-Zellen im Vergleich zu INShigh-Zellen angereichert oder abgereichert sind27. Angereicherte sgRNAs identifizieren positive Regulatorgene, die zu einer Verringerung des Insulingehalts bei Gen-KO führen, und abgereicherte sgRNAs identifizieren negative Regulatorgene, die mit einem Anstieg des Insulingehalts bei Gen-KO verbunden sind. Um die Anzahl falsch-positiver Treffer zu reduzieren, wurden Gene nur dann als Screening-Treffer klassifiziert, wenn sgRNAs konsistente Effekte über alle Replikate hinweg zeigten und den Schwellenwert (FDR < 0,1) für mindestens zwei der vier sgRNAs in beiden unabhängigen Screening-Replikaten erreichten. Insgesamt erfüllten 580 Gene diese strengen Kriterien. Wir betrachteten diese als robuste, reproduzierbare Screening-Treffer und führten sie zur weiteren Bewertung weiter (Ergänzungstabelle 1).

a,b, FACS-Färbung für intrazelluläres Insulin in EndoC-βH1, transduziert mit der CRISPR-Screening-Bibliothek, im Vergleich zu Zellen, die mit EV-Virus transduziert wurden, oder Zellen, die mit Isotyp-passenden Antikörpern gefärbt wurden, dargestellt als Einzeldiagramme (a) und Histogrammüberlagerung (b). c, Veränderungen in der sgRNA-Anzahl von Screening-Proben mit niedrigem zu hohem Insulingehalt, wobei jede Farbe die gleiche sgRNA in den beiden Screen-Replikaten für INS und NKX2-2 darstellt (log2(FC) 1,06 bzw. 1,21). Die schwarze gestrichelte Linie stellt die mittlere sgRNA-Anzahl für dieses Gen dar. d, sgRNA-Verteilung von log2(FC) für alle sgRNAs (blau) im Vergleich zu Kontroll-sgRNAs, die auf LacZ, EGFP und Luciferase abzielen (grau). Die schwarze Linie zeigt die Medianwerte für jede Gruppe. e, sgRNA-Verteilung von log2(FC) innerhalb jedes Screening-Replikats, wobei spezifische sgRNAs von Interesse (vier pro Gen) in einzelnen Farben pro Gen hervorgehoben sind, während die gesamte sgRNA-Verteilung in hellgrau dargestellt ist. f, Einzelne interessierende Gene mit ihren jeweiligen sgRNAs pro Replikat. Die Farbe reicht basierend auf dem FDR von nicht signifikant (weiß) bis hoch signifikant (dunkelblau) und stellt somit eine signifikante sgRNA-Anreicherung oder -Abreicherung zwischen INSlow und INShigh dar. INS (+) und NMS (–) im oberen Feld stellen positive bzw. negative Kontrollgene dar. Die Daten stammen aus zwei unabhängigen genomweiten CRISPR-Screening-Replikationen, und die Screen-FDR-Werte wurden mithilfe von MAGeCK (e, f) oder durch einen Zwei-Proben-t-Test (d) bestimmt. log2(FC), log2(fold change); EV, leerer Vektor.

Um die biologische Relevanz dieser Treffer zu bewerten, fragten wir, ob unser Screening in der Lage sei, Gene zu identifizieren, von denen bekannt ist, dass sie an der Insulinregulation und der Betazellfunktion beteiligt sind. sgRNAs, die auf INS abzielen, wurden in der INSlow-Population angereichert, was die Empfindlichkeit des Screenings bestätigt (Abb. 2c, e, f). Die Gesamtanreicherung von INS war geringer als die anderer bekannter Regulatoren der Insulinsekretion, da nur drei von vier sgRNAs eine Wirkung hervorriefen (Abb. 2c, f). Weitere etablierte Regulatoren der Betazellfunktion und Gene, die am monogenen Diabetes oder T2D-Risiko beteiligt sind, wurden unter den Screening-Treffern identifiziert, wie NKX2.2, SLC2A2, PPP1R15B und IGF2 (Abb. 2c, e, f)28,29,30,31 ,32,33,34,35. Nicht zielgerichtete Kontroll-sgRNAs zeigten keinen Einfluss auf den Insulingehalt (Abb. 2d). Zusätzlich zu den direkten Regulatoren des Insulingehalts identifizierte das Screening auch mehrere allgemeine Regulatoren der Transkription und Translation mit indirekten Auswirkungen auf den Phänotyp (Abb. 2f), die alle in CRISPR-Screenings mit längerer Kultivierungsdauer als gemeinsame essentielle Gene klassifiziert wurden36,37, 38.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Screening-Treffer um funktionelle Klassifizierungen angereichert wurden, die an der Regulierung des Insulingehalts beteiligt sind. Der Begriff „Genontologie“ (GO) und die Signalweganalyse der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) hoben Insulin- und Betazellfunktions-assoziierte Kategorien sowie Transkriptions- und Translationskategorien hervor, die mit der Veränderung der gesamten intrazellulären Proteinspiegel übereinstimmen (Abb. 3a)39,40 . Die STRING-Proteinnetzwerkanalyse betonte außerdem die grundlegende Rolle von INS innerhalb des Screens als zentraler Knoten mit mehreren unabhängigen Verbindungen (Abb. 3b)41. Die Screening-Treffer wurden für gemeinsame Proteinnetzwerke erheblich angereichert, was zusätzliches Vertrauen in die Empfindlichkeit zur Identifizierung miteinander verbundener Komplexe bietet (Abb. 3c und erweiterte Daten Abb. 4). Viele Treffer wurden den Funktionskategorien Ubiquitin-vermittelte Proteolyse und Autophagie, mitochondriale ATP-Synthese, Vesikelhandel und Exozytose, GPCR-Signalisierung, Lipidstoffwechsel und MAPK-Signalweg zugeordnet, die alle sowohl bisher unbekannte als auch bekannte Regulatoren des Insulingehalts enthielten Rollen bei der Insulinsekretion oder der Betazellfunktion.

a, Pathway-Anreicherungsanalyse zur Bewertung von KEGG-Pfaden oder GO-Begriffen für biologische Prozesse. Ausgewählte Pfade werden nach P-Wert geordnet angezeigt. b,c, STRING-Pathway-Analyse, die Protein-Protein-Assoziationen zeigt, einschließlich physikalischer und funktioneller Wechselwirkungen zwischen INS und anderen Screening-Hits (b) und für Screening-Hits, die in funktionell assoziierten Gruppen geclustert sind (c).

Als nächstes versuchten wir, unser zelluläres Screening als ergänzenden Störungsbeweis zu nutzen, um die Zuordnung von Effektorgenen an T2D-Loci zu unterstützen. Wir haben drei komplementäre Ansätze angewendet (https://t2d.hugeamp.org), die entwickelt wurden, um genetische Assoziationsergebnisse für T2D mit verschiedenen Quellen genetischer und genomischer Daten zu kombinieren, um Listen der „Effektor“-Gene zu erstellen, bei denen dies am wahrscheinlichsten ist vermitteln die genetischen Assoziationen42,43,44,45. Die zusammengeführten Effektor-Genzuordnungen der drei Methoden erzeugten eine Liste von 336 Kandidaten-Effektor-Transkripten an T2D-Loci, wobei mit allen drei Methoden keine Kandidaten identifiziert wurden. Der Schnittpunkt dieser Liste mit den Screen-Treffern ergab 20 Gene (Ergänzungstabelle 2), für die unser Screening biologische Beweise für eine Rolle in einem krankheitsrelevanten Phänotyp lieferte. Von diesen 20 Genen werden 5 (25 %) Gene durch die kuratierte heuristische Effektor-Gen-Vorhersagemethode als „kausal“ eingestuft, weitere 4 (20 %) Gene werden als „stark“, „mäßig“ und „möglich“ eingestuft.

Um die Leistung unseres Störungsscreenings mit anderen häufig angewandten Ansätzen zur Priorisierung von Effektortranskripten zu vergleichen, untersuchten wir eine relativ bescheidene, wenn auch bisher größte eQTL-Studie mit 420 menschlichen Inselspendern15. In dieser Studie wurde die Kolokalisierung zwischen T2D-GWAS- und Insel-cis-eQTL-Signalen durch zwei Methoden an 20 Loci unterstützt und stieg auf 39, wenn statistische Unterstützung für die Kolokalisierung nur von einem der Ansätze erforderlich war. Während beide Ansätze (CRISPR-Screening und eQTL) eine ähnliche Anzahl von Genen identifizierten, war ihnen kein Gen gemeinsam, was darauf hindeutet, dass Insel-eQTLs wahrscheinlich nicht zu einem verringerten Insulingehalt führen und dass zusätzliche zelluläre Phänotypen (z. B. Insulinsekretion) ihrer Wirkung zugrunde liegen könnten. Diese Beobachtungen unterstützen die Einbeziehung mehrerer Ansätze für eine optimale Priorisierung von Effektorgenen und ermutigen sowohl größere eQTL-Studien zur Erkennung weiterer Signale als auch eine Ausweitung gezielter und/oder genomweiter Screens nach zusätzlichen zellulären Phänotypen über relevante Zelltypen hinweg.

Wir konzentrierten unsere Folgestudien auf eines der 20 vorhergesagten Effektorgene und das Screening traf CALCOCO2, da seine Rolle in menschlichen Betazellen noch nicht erforscht wurde (Abb. 4a)14,46,47,48,49. CALCOCO2 spielt eine entscheidende Rolle bei der selektiven Autophagie, indem es das Abbauziel mit der autophagischen Maschinerie verknüpft50,51. Bisher wurde gezeigt, dass es die Autophagie für eindringende Krankheitserreger (Xenophagie) und beschädigte Mitochondrien (Mitophagie) auslöst50,51,52. CALCOCO2 ist auf einen T2D-GWAS-Locus abgebildet, der normalerweise nach dem Gen TTLL6 benannt ist, wobei die Feinkartierung das Signal in eine ~177-kb-Region aufgelöst hat, die mehrere Gene und 118 Varianten im glaubwürdigen Satz enthält5. Ein unabhängiges kodierendes Variantensignal innerhalb von CALCOCO2 (rs10278, p.Pro347Ala) legt nahe, dass CALCOCO2 als Effektortranskript große Aufmerksamkeit verdient5. Die physiologische Häufung hat gezeigt, dass dieser Ort seinen primären Einfluss auf das Krankheitsrisiko wahrscheinlich durch die Modulation der Betazellfunktion ausübt5. In diesem CRISPR-Screening führte der KO von CALCOCO2 zu einer Verringerung des Insulingehalts (Abb. 4b). Keines der anderen Gene an diesem Ort zeigte im Screening einen Einfluss auf den Insulingehalt, was CALCOCO2 als wahrscheinliches Effektortranskript weiter stützt (Extended Data Abb. 5).

a, Genpriorisierungsansatz, bei dem Gene mit geringer Evidenz als T2D-Effektortranskripte bewertet werden (wie im Integrationsansatz beschrieben), die ebenfalls als Screening-Treffer identifiziert wurden, hob CALCOCO2 hervor. b, Veränderungen in der sgRNA-Anzahl von Proben mit niedrigem zu hohem Insulingehalt, wobei jede Farbe die gleiche sgRNA in den beiden Screen-Replikaten darstellt. Die schwarze gestrichelte Linie stellt die mittlere sgRNA-Anzahl für dieses Gen dar (log2(FC): 1,08). c–n, Alle Daten stammen von mit siCALCOCO2 behandelten EndoC-βH1 im Vergleich zu nicht zielgerichteten Kontrollzellen. c, mRNA-Expression von CALCOCO2 (P = 0,0002). d, Proteingehalt von CALCOCO2 und seine Ladungskontrolle GAPDH. e, Quantifizierung der CALCOCO2-Western-Blot-Daten, normalisiert auf GAPDH- und siNT-Kontrollzellen (P = 0,0008). f, Zellzahlmessungen. g, Insulingehalt in pg pro 20.000 Zellen, gemessen mit alphaLISA (P = 0,0166). h, Proteinspiegel von Insulin und seine Ladungskontrolle GAPDH. Der Antikörper erkennt auch Insulinvorläufer, gibt aber im Vergleich zu reifem Insulin nur ein schwaches Signal ab. i, Quantifizierung von Insulin- und Western-Blot-Daten, normalisiert auf GAPDH- und siNT-Kontrollzellen (P = 0,0015). j, mRNA-Expression von INS. k,m, Insulinsekretion normalisiert auf siNT (k; P = 0,0051, 0,0336, 0,0282 und 0,0152) oder auf Insulingehalt und siNT (m) in 1 mM, 20 mM, 1 mM + 100 μM Tolbutamid oder 20 mM Glucose + 100 μM Diazoxid. l,n, Änderung der Insulinsekretionsfalte von 1 bis 20 mM Glukose, normalisiert auf siNT (l) oder auf Insulingehalt und siNT (n). Der Proteingehalt wird als Prozentsatz von siNT angezeigt, der bei 100 % als gepunktete Linie hervorgehoben ist. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei (c,e,i,j,m,n), vier (f), sechs (k,l) oder 12 (g) unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden mithilfe des T-Tests bei zwei Stichproben (c), des T-Tests bei einer Stichprobe (e,i), einer einfaktoriellen (f,g,j,l,n) oder zweifaktoriellen (k,m) ANOVA mit analysiert Sidaks Mehrfachvergleichstest. Keine grafische Darstellung der Signifikanz deutet auf nichtsignifikante Ergebnisse hin. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. FC, Faltwechsel; NT, nicht zielgerichtet.

Quelldaten

Wir haben eine unabhängige Bestätigung der Auswirkung des CALCOCO2-Verlusts durch siRNA-basierten Knockdown in EndoC-βH1 erhalten. Die Stummschaltung von CALCOCO2 war hocheffizient und führte zu einer mittleren mRNA- und Proteinreduktion von 78,1 % und 80,0 % (Abb. 4c–e und erweiterte Daten, Abb. 7). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nicht beeinträchtigt (Abb. 4f). Der intrazelluläre Insulingehalt wurde mit zwei unabhängigen, auf Antikörpern basierenden Nachweismethoden bestimmt. Die Empfindlichkeit des CRISPR-Screenings wird dadurch hervorgehoben, dass der Insulingehalt in CALCOCO2-stummgeschalteten Zellen signifikant um 24,0 % bzw. 38,0 % reduziert wurde, gemessen mit alphaLISA bzw. Western Blot (Abb. 4g – i). Dieser Effekt könnte durch Überexpression von CALCOCO2, das stille Mutationen beherbergt, behoben werden, um die Stummschaltung von siRNA zu verhindern (Erweiterte Daten, Abb. 5). Die Verringerung des Insulingehalts war nicht auf eine verminderte Insulin-Genexpression zurückzuführen (Abb. 4j).

Um zu bestätigen, dass dieses Screening T2D-assoziierte Gene, die die Betazellfunktion modulieren, korrekt identifizierte, untersuchten wir zusätzliche Gene, von denen vorhergesagt wurde, dass sie für T2D ursächlich sind, die nicht als Screening-Treffer identifiziert wurden (Extended Data Abb. 6)43. QSER1 und PLCB3 enthalten Kodierungsvarianten, die mit einer ursächlichen Rolle bei T2D übereinstimmen, deren Wirkungsmechanismus oder Wirkgewebe jedoch ungeklärt ist5,53. In Übereinstimmung mit unseren negativen Screening-Ergebnissen hatte der siRNA-Knockdown beider Gene keinen Einfluss auf den intrazellulären Insulingehalt oder die Insulinsekretion. Insgesamt war dieses genomweite CRISPR-Screening in der Lage, eine insulinregulierende Funktion von CALCOCO2 zu identifizieren und gleichzeitig andere Phänotypen zu unterscheiden, die wahrscheinlich mit der Entwicklung von Inselzellen (QSER1) oder der Insulinwirkung (PLCB3) zusammenhängen.

Während wir gezeigt haben, dass der Insulingehalt bei Verlust von CALCOCO2 sinkt, kann aus Änderungen des Insulingehalts nicht auf eine veränderte glukosestimulierte Insulinsekretion geschlossen werden. Wir haben daher unabhängig die Auswirkungen des CALCOCO2-Knockdowns auf die Insulinsekretion untersucht. Im Durchschnitt wurde die Insulinsekretion durch die Stummschaltung von CALCOCO2 signifikant um 39,3 % reduziert (Abb. 4k). Der Glukosestimulationsindex von niedrigem zu hohem Glukosespiegel blieb jedoch unverändert, was auf eine angemessene Reaktion auf Änderungen der Glukosekonzentrationen hinweist (Abb. 4l). Die Normalisierung des Insulingehalts reduzierte den Unterschied zwischen CALCOCO2-stillgelegten Zellen und Kontrollen auf 30,2 %. Auch wenn das Niveau der Insulinsekretion nach der Normalisierung nicht den Ausgangswert erreichte, war der Effekt statistisch nicht signifikant und machte einen verringerten Insulingehalt als zugrunde liegende Ursache für die Verringerung der Gesamtinsulinsekretion deutlich (Abb. 4m, n).

Wir haben unsere Studien erweitert, um die CALCOCO2-Funktion in primären menschlichen Pankreasinseln zu bewerten. Immunfluoreszenzstudien an menschlichen Bauchspeicheldrüsenschnitten bestätigten die Proteinexpression und Lokalisierung im Zytoplasma von Betazellen (Abb. 5a und erweiterte Daten Abb. 7). Um festzustellen, ob die Auswirkungen des CALCOCO2-Verlusts über In-vitro-Modelle und Betazellen hinaus reproduziert werden können, führten wir einen shRNA-Knockdown in primären menschlichen Inseln durch. Inseln wurden dispergiert, mit shRNA, die auf CALCOCO2 abzielt (shCALCOCO2), transduziert und zu Pseudoinseln reaggregiert (Abb. 5b). Die erfolgreiche Transduktion von Pseudoinseln wurde durch die Beurteilung der Koexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) bestätigt (Abb. 5c). Die CALCOCO2-Expression war im Vergleich zur nicht zielgerichteten Kontroll-shRNA (shNT; Abb. 5d) im Durchschnitt um 54,0 % reduziert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei EndoC-βH1 zeigte intrazelluläres Insulin eine bescheidene, aber konsistente Reduzierung um 15,7 % (Abb. 5e). Obwohl die Abnahme des intrazellulären Insulins in Pseudoinseln geringer war als in EndoC-βH1, wurde sie sowohl in der Zelllinie als auch im primären menschlichen Gewebe im gleichen Ausmaß reduziert, wenn sie auf die erreichte Stummschaltungseffizienz normalisiert wurde, was einen Zusammenhang zwischen CALCOCO2-Spiegeln und Funktion stützt. Pseudoislets zeigten jedoch keine signifikante Beeinträchtigung der Insulinsekretion (Abb. 5f, g). Die Stimulation mit hohem Glukosegehalt und dem Sekretionsverstärker IBMX erhöhte die Insulinsekretion bei Normalisierung des shCALCOCO2-Gehalts. Dieser Effekt ging bei der Normalisierung auf genomische DNA verloren und spiegelt daher den Einfluss von Änderungen im Insulingehalt auf die Sekretion wider. In ähnlicher Weise haben wir den Glucagongehalt und die Glucagonsekretion untersucht, um mögliche Auswirkungen von CALCOCO2 in Alphazellen zu identifizieren (Abb. 5h – j). Während shCALCOCO2 einen gewissen Trend zu einer abgeschwächten Glucagonsekretion zeigte, änderte sich weder der sekretorische Zustand noch der Glucagongehalt signifikant. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass CALCOCO2 eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Insulingehalts in menschlichen Betazellen spielt.

a, Immunfluoreszenzfärbung primärer menschlicher Inseln in Pankreasschnitten. Die Schnitte wurden für INS (grün) und CALCOCO2 (rot) doppelt gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. b–j, Alle Daten stammen von shCALCOCO2-Pseudoinseln im Vergleich zu Nicht-Targeting-Kontroll-Pseudoinseln (shNT). b, Pseudoislet-Transduktion und -Bildung aus primären menschlichen Inseln. c, shCALCOCO2-Pseudoinseln unter Hellfeld (oben) und GFP-positive Pseudoinseln (unten). Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. d, mRNA-Expression von CALCOCO2. e,h, intrazellulärer Insulin- (e) und Glucagon- (h) Gehalt. f,g,i,j, Sekretion von Insulin (f,g) oder Glucagon (i,j), normalisiert auf den Inhalt (f,i) oder auf genomische DNA (gDNA) (g,j) in 2,8, 5,6, 16,7 oder 16,7 mM Glucose + IBMX für die Insulinsekretion und 7, 1, 1 mM Glucose + ʟ-Arginin oder KCl für die Glucagonsekretion. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Spendern und drei unabhängigen Immunfluoreszenzfärbungen. ʟ-Arg, ʟ-Arginin; FC, Faltwechsel; NT, nicht zielgerichtet.

Der Mechanismus, der der Regulierung des Insulingehalts in menschlichen Betazellen durch CALCOCO2 zugrunde liegt, muss jedoch noch erforscht werden. Um eine unvoreingenommene Bewertung der mRNA-Expressionsänderungen in siCALCOCO2-behandeltem EndoC-βH1 durchzuführen, führten wir eine RNA-Sequenzierung (RNA-seq) durch (Ergänzungstabelle 5). Es wurde festgestellt, dass nur CALCOCO2 signifikant unterschiedlich exprimiert wird, was auf einen primär posttranskriptionellen Mechanismus des Insulingehalts schließen lässt. Obwohl unterhalb der Signifikanzschwelle, sind die nächsten beiden Gene (B4GALT5 und GCNT1) in der Liste der unterschiedlich exprimierten Gene an der Glykosylierung/O-Glykan-Verarbeitung beteiligt (Extended Data Abb. 8). Die Glykosylierung ist an der Regulierung der Autophagie beteiligt und zusammen mit der etablierten Rolle von CALCOCO2 als Autophagierezeptor haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Wirkung von CALCOCO2 auf den Insulingehalt durch Autophagie vermittelt wird50,51,54,55,56,57.

Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die zelluläre Lokalisierung von CALCOCO2 in EndoC-βH1 festzustellen und zeigte keine Kolokalisation mit Insulinvesikeln (Extended Data Abb. 7). Als nächstes führten wir eine Elektronenmikroskopie (EM) durch, um mögliche zelluläre ultrastrukturelle Veränderungen nach der CALCOCO2-Stummschaltung zu bewerten. Entsprechend dem verringerten Gesamtinsulingehalt in gepoolten Messungen wurde die Insulinvesikeldichte bei der CALCOCO2-Stummschaltung deutlich verringert (Abb. 6a, b). Der Anteil reifer Insulinkörnchen war im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht, was darauf hindeutet, dass eine Verringerung der unreifen und sich im Übergang befindenden Körnchen die Auswirkung auf den Gesamtinsulingehalt beeinflusst (Abb. 6a, c). Dies wurde weiter bestätigt, da die Dichte reifer Körnchen unverändert blieb (Abb. 6d). Gepoolte Messungen bestätigten unabhängig voneinander die strukturellen EM-Daten, da intrazelluläres Prä-/Proinsulin (als Proinsulin bezeichnet) bei der Stummschaltung signifikant reduziert wurde, ein Effekt, der bei der Normalisierung auf den Gesamtinsulingehalt nicht verloren ging (Abb. 6e, f). Diese Verringerung des Proinsulins wurde wahrscheinlich nicht durch eine veränderte Insulinreifung verursacht, da die Expression von Genen, die an der Insulinverarbeitung beteiligt sind (PCSK1, CPE und PCSK2), unverändert blieb, obwohl die Enzymaktivität nicht bewertet wurde (Extended Data, Abb. 8).

a–l, siCALCOCO2-behandeltes EndoC-βH1 im Vergleich zu siNT. a, Repräsentative Bilder mit unreifen Insulinkörnchen (kurze weiße Pfeilspitzen), reifen Körnchen (lange weiße Pfeilspitzen) und vakuolischen Strukturen (schwarz/weiße Pfeilspitzen). b, Quantifizierung der Insulinkörnchen pro Quadratmikrometer (P = 0,0137). c, Quantifizierung reifer Insulinkörnchen normalisiert auf die Gesamtzahl der Körnchen pro Zelle (P < 0,0001). d, Quantifizierung reifer Insulinkörnchen, normalisiert auf Quadratmikrometer. e, Proinsulin (ELISA), normalisiert auf siNT (P = 0,0033). f, Proinsulin normalisiert auf Gesamtinsulin (ELISA) und siNT (P = 0,0081). g, Repräsentative EM-Bilder mit Vergrößerungen (oben rechts), Mitochondrien (weiße Pfeilspitzen) und vakuolischen Strukturen (schwarz/weiße Pfeilspitzen). h, Quantifizierung der veränderten Mitochondrien, normalisiert auf die Gesamtzahl der Mitochondrien (P = <0,0001). i, ATP-Messungen nach Inkubation mit niedrigem/hohem Glukosegehalt, mit/ohne dem Mitophagie-Induktor FCCP. j, Repräsentative Bilder vergrößerter vakuolisierter Strukturen in siCALCOCO2, hervorgehoben in a und g mit schwarz/weißen Pfeilspitzen. k, Repräsentative Färbung für LC3 (links) und INS (Mitte), behandelt mit Bafilomycin A1 (BafA1) oder DMSO. l, Höhere Vergrößerung der angegebenen LC3-Regionen (weißer Kasten). m–p, Intakte nichtdiabetische primäre menschliche Inseln. m,n, Trägerinseln (GC) und Kontrollinseln (CC) für die kodierende Variante rs10278 (schützendes Allel G) in Bezug auf Insulingehalt (m) und Insulinsekretion (n). P = 0,0029. o,p, Inseln mit angegebenem Genotyp bei der GWAS-Leitvariante rs35895680 (schützendes Allel C) in Bezug auf Insulingehalt (o) und Insulinsekretion (p). P = 0,0004. Die Kästchen zeigen den Interquartilbereich zwischen dem ersten und dritten Quartil, den Median (horizontale Linie) und Whiskers vom 10. bis zum 90. Perzentil (m–p). Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei (a,g,i–l) oder vier (e,f) unabhängigen Experimenten; 16 (b,d), 13 (c) und 14 (h) siNT-Zellen und 27 (c), 40 (b,d,h) siCALCOCO2-Zellen über drei unabhängige Experimente und mindestens 21 Spender (Ergänzungstabelle 6; m– P). Homozygote Individuen für rs10278 (GG) wurden aufgrund der geringen Stichprobengröße (m, n) nicht analysiert. Der Maßstabsbalken ist 1 μm (a,g), 0,25 μm (j), 20 μm (k) und 10 μm (l). Die Daten wurden mithilfe des Zwei-Stichproben-t-Tests (b–d,h), des Zwei-Wege-ANOVA-Sidak-Mehrfachvergleichstests (i,m–p) oder des Ein-Stichproben-t-Tests (e,f) analysiert. Keine grafische Darstellung der Signifikanz deutet auf nichtsignifikante Ergebnisse hin. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. NT, nicht zielgerichtet.

Die EM-Analyse ergab, dass die mitochondriale Struktur in siCALCOCO2-Zellen mit verzerrten Kristallen und Formen dramatisch verändert war, was mit einer erhöhten mitochondrialen Trennung oder Spaltung vor dem Targeting durch Autophagie übereinstimmt (Abb. 6g, h)58. Unerwarteterweise blieb die mitochondriale ATP-Produktion jedoch durch die Stimulation mit Glukose unbeeinflusst (Abb. 6i). Die Induktion einer FCCP-vermittelten mitochondrialen Depolarisation zur Auslösung der Mitophagie verringerte die ATP-Produktion gleichermaßen in siCALCOCO2- und Kontrollzellen, was auf eine funktionelle Mitophagie hinweist (Abb. 6i). Die Expressionsniveaus der Mitophagie-Mediatoren PINK1 und PARKIN (PARK2) wurden nicht beeinflusst (Extended Data Abb. 8). Insgesamt gab es keinen Hinweis darauf, dass die Mitochondrienfunktion oder die von außen induzierte Mitophagie durch die CALCOCO2-Stummschaltung beeinträchtigt wurde. Darüber hinaus zeigte siCALCOCO2-stummgeschaltetes EndoC-βH1 eine Ansammlung vakuolisierter Strukturen, von denen viele Reste zellulärer Komponenten enthielten, was Veränderungen in abbaubasierten Mechanismen hervorhob (Abb. 6j).

Als nächstes untersuchten wir, ob diese Verringerung der unreifen Granula und des Proinsulins durch eine Wirkung von CALCOCO2 auf die Autophagie vermittelt wurde. Autophagie ist hochdynamisch und muss künstlich blockiert werden, um die Amplitude des autophagischen Flusses genau zu messen59. Wir inkubierten EndoC-βH1 mit dem lysosomalen Inhibitor Bafilomycin A1 (BafA1), der die Autophagosomen-Lysosom-Fusion und den lysosomalen Abbau verhindert, und bewerteten LC3-positive Puncta, die für Autophagosomen repräsentativ sind. Während die Bildung von LC3-positiven Strukturen unter beiden Bedingungen deutlich zunahm, war die Akkumulation in CALCOCO2-stummgeschalteten Zellen stärker ausgeprägt (Abb. 6k, l). Die Kolokalisierung von LC3-positiven Autophagosomen mit insulinhaltigen Körnchen unterstützte zusätzlich eine durch Autophagie vermittelte Reduktion der Insulinkörnchen bei Verlust von CALCOCO2 (Abb. 6k). Wir bestätigten außerdem, dass die Verringerung der Insulingranula und des Proinsulins nicht durch das Ubiquitin-Proteasom-System vermittelt wurde, da der Proteasom-Inhibitor MG132 den Proinsulingehalt nicht wiederherstellte (Extended Data Abb. 8).

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CALCOCO2 ein Regulator der Insulingranulathomöostase ist und seine beobachtete Wirkung auf den Gesamtinsulingehalt durch eine autophagiebasierte Reduzierung von Proinsulin und unreifen Granula vermittelt.

Nachdem wir CALCOCO2 als Regulator des Insulingehalts identifiziert hatten, untersuchten wir als Nächstes, ob Träger von T2D-Risiko-Allelen am CALCOCO2-Locus ähnliche sekretorische Phänotypen aufwiesen, die CALCOCO2 als Effektortranskript an diesem Locus unterstützen. Wir bewerteten den Insulingehalt und die Insulinsekretion in intakten primären Inseln von nichtdiabetischen Organspendern, die nach ihren Genotypen geschichtet waren, bei zwei unabhängigen T2D-Assoziationssignalen am CALCOCO2-Locus (Ergänzungstabelle 6). Wir haben eine wahrscheinlich kausale Kodierungsvariante (rs10278), die in einer Exom-Array-Studie identifiziert wurde, und die führende GWAS-Variante aus der großen, zu 99 % glaubwürdigen Menge (118 Varianten) am T2D-assoziierten Locus (rs35895680)5 ausgewählt. Es wird vorhergesagt, dass die Variante rs10278 bei den meisten Isoformen, einschließlich der Hauptisoform in menschlichen Inseln (NM_005831)5, zu einer Substitution von Prolin durch Alanin am Codon 347 führt. Sein Wirkungs-Allel G, das mit einem verringerten T2D-Risiko verbunden ist, zeigte eine veränderte glukosestimulierte Insulinsekretion, jedoch keinen veränderten Insulingehalt in den Primärinseln (Abb. 6m, n). Die GWAS-Leitvariante rs35895680 (Allel C reduziert das Risiko), die sich in einem starken Bindungsungleichgewicht mit einer Variante im glaubwürdigen Satz befindet, die sich in der 3′-UTR von CALCOCO2 befindet, hatte keinen Einfluss auf den Insulingehalt. Inseln von Individuen, die homozygot für das T2D-schützende Allel sind, zeigten jedoch unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel eine erhöhte Insulinsekretion im Vergleich zu denen mit einer Kopie (Abb. 6o, p). Gemeinsam zeigen wir, dass mit CALCOCO2 assoziierte T2D-assoziierte Risikovarianten die Insulinsekretion in primären menschlichen Inseln beeinflussen, obwohl die Beziehungen der Variante zum Insulingehalt und zur CALCOCO2-Funktion noch untersucht werden müssen.

Jüngste Bemühungen zur Identifizierung von Effektortranskripten an GWAS-Assoziationssignalen konzentrierten sich auf die Integration krankheitsrelevanter transkriptomischer und epigenomischer Datensätze oder auf detaillierte mechanistische Studien an einem einzelnen Ort4,7,14,15,23,47,60,61,62,63,64 . Genomweite Störungsdatensätze in krankheitsrelevanten Zelltypen könnten die Lücke zwischen Effektortranskript und Krankheitsbiologie schließen und gezielte Translationsbemühungen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein genomweites gepooltes CRISPR-LoF-Screening, um eine umfassende Charakterisierung der Regulatoren des Insulingehalts in der menschlichen Beta-Zelllinie EndoC-βH1 durchzuführen.

Unser CRISPR-Screening-Ansatz war erfolgreich bei der Identifizierung robuster Modulatoren des Insulingehalts, wie durch den Nachweis nicht nur des Insulingens selbst, sondern auch von Genen, die an monogenen Diabetestypen beteiligt sind, oder bekannten Regulatoren der Insulintranskription und -sekretion gezeigt wurde. Durch die Integration unserer Screening-Treffer mit Priorisierungstools wurden 20 Gene als Effektortranskripte identifiziert, die auf Betazelldysfunktionen wirken. Unsere Daten ergänzen eine wachsende Zahl genomweiter Multi-Omic-Datensätze, die genutzt werden können, um genetische Entdeckungen und biologische Mechanismen zu verbinden und als Modell für zukünftige Zellstudien nicht nur an menschlichen Betazellen zu dienen. Darüber hinaus werden unsere unvoreingenommenen genomweiten Daten für andere Merkmale/Krankheiten relevant sein, bei denen die Betazelle der Bauchspeicheldrüse eine Rolle spielt, einschließlich Typ-1-Diabetes.

Wir haben zunächst das T2D-Risiko-assoziierte Gen CALCOCO2 als CRISPR-Screening-Treffer und positiven Regulator des Insulingehalts identifiziert. Wir haben dieses Gen für weitere Untersuchungen ausgewählt, da es das Potenzial hat, einem T2D-GWAS-Signal zugrunde zu liegen, und weil es an Wissen über seine Rolle in der Betazellbiologie mangelt. Unsere fokussierten Funktionsstudien bestätigten seine Wirkung auf den Insulingehalt und zeigten eine indirekte, durch den Insulingehalt vermittelte Verringerung der Insulinsekretion. Wir liefern daher funktionelle Daten, die CALCOCO2 mit der Betazellfunktion in Verbindung bringen, einem wahrscheinlichen Effekt auf die Pathogenese der Krankheit und das Wirkgewebe, und erweitern damit den Beweis für eine mögliche kausale Rolle beim T2D-Risiko (ergänzende Diskussion)5,53,65.

Während CALCOCO2 als essentieller Rezeptor bei der Parkin-vermittelten Mitophagie beschrieben wurde und obwohl wir eine veränderte mitochondriale Ultrastruktur beobachteten, führte sein Verlust nicht zu einer Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion in EndoC-βH1 oder einer verringerten Clearance von Mitochondrien nach künstlicher Induktion der Mitophagie, was auf a hindeutet Mitochondrienunabhängiger Mechanismus bei der Regulierung des Insulingehalts durch CALCOCO252,66,67,68. Stattdessen belegen unsere Ergebnisse eine Auswirkung auf den Insulingehalt durch den Abbau von Proinsulin enthaltenden unreifen Insulinkörnchen. Während die Auswirkungen der kodierenden T2D-Risikovariante in CALCOCO2 auf Expression und Funktion noch geklärt werden müssen, könnte die beobachtete verringerte Insulinsekretion die langfristigen Auswirkungen einer veränderten Insulin-Granulat-Homöostase durch angepasste Insulinexpression und Granulat-Biogenese zum Ausgleich von Veränderungen im Granulat darstellen Abbau, der zu einem betroffenen Pool reifer und sekretionsbereiter Körnchen führt.

Während dieses genomweite CRISPR-Screening Gene identifiziert hat, die an der Betazellfunktion beteiligt sind, und eine Ressource für zukünftige Integration und eingehende Studien bietet, erfasst es nur einen krankheitsrelevanten zellulären Phänotyp in einer Erkrankung. Bei dem Screening wurden Veränderungen des Insulingehalts unter basalen Glukosebedingungen bewertet. Folglich wurden Gene, die die Insulinsekretion beeinflussen, ohne den Insulingehalt zu modulieren, oder Veränderungen des intrazellulären Gehalts, die nur bei Glukosemangel oder -stimulation auftreten, nicht erfasst.

Dies ist ein wichtiger Schritt zur Beschleunigung der Bemühungen um genomweite Screens, sowohl des Funktionsverlusts als auch des Funktionsgewinns in krankheitsrelevanten menschlichen Zelllinien für T2D, und stellt einen Konzeptnachweis dafür dar, dass zelluläre Screens die genomischen Bemühungen durch die Verknüpfung von Varianten mit regulatorischen Elementen und Transkripten verstärken können Überbrücken Sie die Lücke zwischen Genexpression und krankheitsrelevanter Zellbiologie. Zusammenfassend haben wir ein genomweites gepooltes CRISPR-Screening in einem Modell menschlicher Betazellen entwickelt und durchgeführt und so einen umfassenden Störungsdatensatz bereitgestellt, um interessierende Gene mit einer Wirkungsrichtung, einem Wirkgewebe und einem Funktionsmechanismus zu verknüpfen. Wir haben erfolgreich gezeigt, wie ein genomweiter Störungssatz als Priorisierungsinstrument für kausale Gene an T2D-GWAS-Loci verwendet werden kann, und heben CALCOCO2 als Modulator der Insulingranulat-Homöostase und der Betazellfunktion hervor, der wahrscheinlich eine kausale Rolle bei T2D spielt.

Menschliche Pankreasinseln und Pankreasgewebe wurden von verstorbenen Spendern mit ethischer Genehmigung des Human Research Ethics Board der University of Alberta (Pro00013094, Pro00001754) isoliert und vom NIDDK-finanzierten Integrated Islet Distribution Program (IIDP) (RRID:SCR _014387) bezogen. und das National Diabetes Research Institute (NDRI; https://ndriresource.org/). Die Familien aller Spender gaben ihre Einwilligung zur Verwendung von Bauchspeicheldrüsengewebe in der Forschung und erhielten keine finanzielle Entschädigung. HEK293T und EndoC-βH1 wurden von Sigma (12022001) bzw. EndoCells, jetzt bekannt als https://www.humancelldesign.com, erhalten19.

HEK293T-Zellen wurden routinemäßig in DMEM 6429 (Sigma-Aldrich) passagiert, das 10 % fötales Kälberserum (FCS), 100 U ml-1 Penicillin und 100 µg ml-1 Streptomycin enthielt. EndoC-βH1 wurde routinemäßig passagiert, wie in den ergänzenden Methoden beschrieben. Alle Zellen waren frei von Mykoplasmen (Lonza) und wurden bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Falls angezeigt, wurden EndoC-βH1-Zellen 7 Stunden lang mit 10 nM BafA1, 1 μM MG132 oder DMSO behandelt (alle Sigma-Aldrich).

Nicht identifizierte Proben menschlicher Inseln und Bauchspeicheldrüse für Immunfärbungen und funktionelle shRNA-Experimente wurden von vier nichtdiabetischen Organspendern erhalten, die über das IIDP und das Alberta Diabetes Institute Islet Core69 beschafft wurden. Menschliche Inseln für T2D-Risiko-Allel-Studien wurden von 194 nicht-diabetischen Organspendern (Hämoglobin A1C (HbA1C) < 6) gewonnen, isoliert und am Alberta Diabetes Institute IsletCore wie zuvor beschrieben bewertet und in DMEM mit 10 % FCS und 100 U ml-1 Penicillin kultiviert /Streptomycin (alle Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C und 5 % CO2 (Ref. 69,70). Menschliches Bauchspeicheldrüsengewebe wurde über das NDRI beschafft. Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Spendern sind in den Ergänzungstabellen 3 und 6 aufgeführt. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Alter, Geschlecht, BMI oder HbA1c zwischen den Gruppen. DNA wurde aus verdautem exokrinen Pankreasgewebe mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) extrahiert und die Genotypisierung wurde auf einem Infinium Omni2.5Exome-8 BeadChip-Array (Illumina) durchgeführt.

Einzelne CRISPR-sgRNAs wurden wie in den ergänzenden Methoden beschrieben in plentiCRISPRv2 (Addgene, 52961) kloniert. Kurz gesagt, BsmBI-kompatible Schwänze wurden zu komplementären sgRNA-Oligonukleotiden hinzugefügt und angelagert (Ergänzungstabelle 4). PlentiCRISPRv2 wurde verdaut und mit annealten sgRNA-Oligonukleotiden ligiert, gefolgt von Transformation und Amplifikation in kompetenten Zellen. Die korrekte sgRNA-Integration wurde durch Sanger-Sequenzierung validiert und Plasmide wurden weiter zur Produktion von Lentivirus verwendet.

Die Toronto Human Knockout Pooled Library (TKOv3) mit 71.090 sgRNAs basierend auf einem lentiCRISPRv2-Rückgrat war ein Geschenk von Jason Moffat, University of Toronto (Addgene, 90294)26. Die Bibliothek wurde in Endura Competent Cells (Lucigen) transformiert und amplifiziert, wie in den ergänzenden Methoden26 beschrieben. Die Transformationseffizienz wurde durch serielle Verdünnung bestimmt, um die sgRNA-Repräsentation sicherzustellen, und die Plasmide wurden anschließend mit Plasmid Mega-Kits (Qiagen) extrahiert. Eine Sequenzierungsbibliothek wurde wie unten beschrieben vorbereitet und die Darstellung der Bibliothek durch Sequenzierung auf einem NextSeq500 (Illumina) unter Verwendung von 75-bp-Single-End-Reads bestätigt.

Lentivirus für einzeln geklonte sgRNAs und gepoolte Bibliotheken wurde wie in den ergänzenden Methoden beschrieben hergestellt und titriert. Kurz gesagt, CRISPR-Plasmide wurden in 60 % konfluentem HEK293T mit den Verpackungsvektoren pMD2.G (Addgene, 12259) und psPAX2 (Addgene, 12260) unter Verwendung von jetPRIME-Transfektionsreagenzien (Polyplus-Transfektion) cotransfiziert. Der Virusüberstand wurde 48 und 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Der funktionelle Virustiter wurde in EndoC-βH1 durch Messung des Prozentsatzes des Überlebens nach Transduktion mit verschiedenen Virusverdünnungen und Antibiotikaauswahl bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay (Invitrogen) bewertet. Die erforderliche Menge an Lentivirus, um eine Überlebensrate von 26 % zu erreichen, was einem MOI von 0,3 entspricht, wurde berechnet und in nachfolgenden kleinen oder genomweiten Screening-Transduktionen verwendet. EndoC-βH1-Zellen wurden 48 Stunden nach der Aussaat für 6 Stunden transduziert und für 7 Tage in 4 μg ml-1 Puromycin mit Medienwechseln nach Bedarf selektiert.

Zwei unabhängige genomweite CRISPR-Screens wurden nacheinander in EndoC-βH1 mit unabhängigen lentiviralen CRISPR-Bibliothekstransduktionen, FACS und sgRNA-seq durchgeführt. Jedes Screening wurde mit einer Abdeckung von 500 Zellen pro sgRNA und einer MOI von 0,3 durchgeführt. Insgesamt wurden 670 Millionen bzw. 744 Millionen Zellen in Replikat eins bzw. zwei transduziert. Die Zellen wurden wie beschrieben transduziert und 7 Tage lang in 4 μg ml-1 Puromycin inkubiert, wobei die Medien nach Bedarf gewechselt wurden, gefolgt von Sammeln, Färben und FACS-Analyse.

EndoC-βH1-Zellen wurden gesammelt und mit LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain (Thermo Fisher Scientific) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und in 1 % BSA in PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit dem BD Cytofix/Cytoperm-Kit (BD Biosciences) 20 Minuten lang bei 4 °C fixiert und permeabilisiert und mit Perm/Waschpuffer (BD Biosciences) gewaschen. Die Färbung mit Primärantikörpern wurde über Nacht bei 4 °C durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit geeigneten Sekundärantikörpern, verdünnt in Perm/Waschpuffer (Ergänzungstabelle 4). Beim Testen mehrerer auf INS gerichteter Antikörper wurde im genomweiten Screening ein monoklonaler Kaninchen-Anti-INS-Antikörper von Cell Signaling (3014) verwendet. Die Proben wurden durch ein 70-μm-Zellsieb filtriert und auf einem FACSAria III (BD Biosciences) unter Verwendung einer 100-μm-Düse sortiert. Neben den Proben wurden auch mit jedem Antikörper allein gefärbte Isotyp- und Transduktionskontrollen analysiert. Die Proben wurden vor der Beurteilung des INS-Gehalts anhand lebender und einzelner Zellen kontrolliert. Gates für Zellen mit reduziertem INS-Spiegel (INSlow) wurden basierend auf der Isotypkontrolle festgelegt und die höchsten 10 % der INS-exprimierenden Zellen wurden als INShigh sortiert. Sortierte Zellproben wurden bis zur DNA-Extraktion bei –80 ° C gelagert. Durchflusszytometriedaten wurden mit Flowjo 10.6 (BD Biosciences) analysiert.

DNA wurde aus gefrorenen FACS-sortierten Proben mit dem QIAamp Blood Maxi/Mini Kit (Qiagen) extrahiert und für die Sequenzierung in einem zweistufigen PCR-Ansatz verarbeitet. Integrierte sgRNAs wurden mithilfe der Q5-Polymerase (NEB) mit 2,5 μg DNA-Input pro Reaktion und einer optimierten Anzahl von Zyklen pro Probe amplifiziert. Spezifische Illumina TruSeq-Adapter wurden an jeder Probe unter Verwendung von Q5-Polymerase (NEB) mit einer optimierten Anzahl von Zyklen angebracht (Ergänzungstabelle 4). PCR-Produkte wurden auf einem 2 %igen Gel laufen gelassen und mit dem QIAquick Gel-Extraktionskit (Qiagen) gereinigt. Jede Illumina-Bibliotheksprobe wurde vor dem Pooling mit dem KAPA Library Quantification Kit (Roche) qPCR-basiert quantifiziert, und die Multiplex-Sequenzierung auf einem NEXTSeq500 (Illumina) wurde als 75-bp-Reads mit Standard-Illumina-Sequenzierungsprimer und PhiX bis zu etwa 20 % Spike-in durchgeführt.

Rohe Lesedateien für die Fastq-Sequenzierung wurden für jede Probe mit dem Befehl „cat“ zusammengeführt. Um angereicherte und abgereicherte sgRNAs in diesem CRISPR-Screening zu identifizieren, verwendeten wir den MAGeCK-Algorithmus (v0.5.9.2)27. Kurz gesagt wurde der Befehl „count“ verwendet, um sgRNA-Sequenzen aus den rohen Fastq-Dateien basierend auf der TKOv3-Bibliothekseingabe zu extrahieren und zu zählen, was eine mittlere Lesezahl von 981 ausgerichteten Lesevorgängen pro sgRNA ergab (Extended Data Abb. 3). sgRNAs mit niedrigen Lesezahlen von weniger als 10 und sgRNAs, die auf Gene abgebildet sind, die nicht in EndoC-βH1 exprimiert wurden, wurden ausgeschlossen. Der Befehl „test“ wurde mit dem gepaarten Modul verwendet, um die sgRNA-Anreicherung oder -Depletion zwischen INSlow- und INShigh-Populationen zu bewerten und zu analysieren. Der Analysemedian normalisiert die Lesezahlen über die Proben hinweg, um unterschiedliche Lesezähltiefen zu berücksichtigen, und wendet ein Mittelwert-Varianz-Modell an, um eine signifikante sgRNA-Anreicherung oder -Verarmung zu identifizieren. Die durch MAGeCK-Mehrfachtests angepassten Anreicherungswerte auf sgRNA-Ebene bildeten die Grundlage für die Trefferselektion auf Genebene. Wir haben zusätzliche strenge Kriterien angewendet, um nur Treffer mit sehr konsistenten Effekten in beiden Replikaten zu priorisieren, was erfordert, dass Gene für mindestens zwei von vier sgRNAs in beiden unabhängigen Replikaten einen FDR < 0,1 aufweisen. Die CRISPR-Bildschirmanalyse wurde in Python 3.8 und R 3.5 durchgeführt.

Angereicherte GO- und KEGG-Pfade innerhalb der Screening-Treffer wurden mithilfe der Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery 6.8 mit Homo Sapiens als Liste und Hintergrundeingabe ermittelt39. Unter den Screening-Treffern wurden mithilfe von STRING v11 (Lit. 41) Proteinkonnektivitätsnetzwerke identifiziert, die auf physikalischen und funktionellen Interaktionen basieren. Es wurden nur Interaktionen mit einem hohen Konfidenzwert von ≥0,9 ausgewählt.

Die Vorwärts-siRNA-basierte Stummschaltung in EndoC-βH1 wurde 24 Stunden nach der Ausplattierung unter Verwendung von ON-TARGET plus SMARTpool-siRNAs oder einer nicht zielgerichteten Kontrolle (Dharmacon; Ergänzungstabelle 4) bei einer Endkonzentration von 15 nM durchgeführt. siRNAs wurden mit 0,4 % Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) in Opti-MEM-reduziertem serumfreiem Medium (Gibco) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert, bevor sie tropfenweise zur Kultur hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion untersucht oder gesammelt. Die CALCOCO2-Stummschaltung in den in Abb. 6 dargestellten Experimenten wurde bei einer Endkonzentration von 50 nM siRNA durchgeführt und nach 96 Stunden bewertet.

Lentivirale Konstrukte, die für shRNAs kodieren, die auf menschliches CALCOCO2 abzielen, wurden von Dharmacon erhalten (Ergänzungstabelle 4), und das Virus wurde wie oben beschrieben produziert. Primäre Inseln wurden durch enzymatischen Verdau (Accumax, Invitrogen) in einzelne Zellen zerlegt und 1 × 106 Zellen wurden mit 1 × 109 Viruseinheiten pro 1 ml transduziert. Transduzierte Inselzellen wurden vor der weiteren Analyse 5 Tage lang in Platten mit Ultralow-Attachment-Wells kultiviert.

An vier Zielstellen wurden stille Mutationen in das CDS von menschlichem CALCOCO2 eingeführt, basierend auf den Zielregionen der ON-TARGET plus SMARTpool CALCOCO2-siRNA. Restriktionsstellen, die EcoRI- und BamHI-Motive und Kozak-Sequenzen enthielten, wurden an den 5'- und 3'-Terminus des CDS hinzugefügt. Das Genfragment wurde synthetisiert (IDT) und in das Plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP kloniert. Leeres Plasmid diente in nachfolgenden Experimenten als Kontrolle. Lentivirus wurde wie oben beschrieben produziert und EndoC-βH1-Zellen wurden mit einer MOI von 0,5 transduziert.

RNA für die Genexpressionsanalyse von EndoC-βH1 wurde mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen) extrahiert und unter Verwendung des GoScript Reverse Transcriptase System (Promega) zu komplementärer DNA synthetisiert. RNA für die Genexpressionsanalyse aus primären menschlichen Pseudoinseln wurde mit dem PicoPure RNA-Isolierungskit (Life Technologies) extrahiert und cDNA wurde mit dem Maxima-Erststrang-cDNA-Synthesekit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Quantitative qPCR (qPCR) wurde unter Verwendung von TaqMan-Echtzeit-PCR-Assays auf einem 7900HT Fast Real-Time PCR-System (alle Applied Biosystems, Ergänzungstabelle 4) durchgeführt. Die Ct-Werte wurden mit der ΔΔCt-Methode analysiert und die Zielgene auf den kombinierten Durchschnitt der Housekeeping-PPIA, GAPDH und TBP normalisiert. Die CALCOCO2-Expression in EndoC-βH1 und primären Inseln wurde aus zuvor veröffentlichten und analysierten RNA-seq-Daten extrahiert71,72.

Die RNA-Seq wurde unter Verwendung von PolyA-Capture mit durchschnittlich >20 Millionen Paired-End-Reads auf einem NEXTSeq500 (Illumina) durchgeführt. Fastq-Dateien wurden mithilfe von STAR v2.7.9a (Spliced ​​Transcripts Alignment to Reference) mit ENSEMBL-Genanmerkungen (v101) an der menschlichen Genomreferenz (GRCh38) ausgerichtet. Die Genexpressionsniveaus wurden mithilfe von featureCounts (v2.0.1) bei exonischen Lesevorgängen gezählt. Die differenzielle Expression wurde mithilfe des Wald-Tests in DESeq2 (v1.26.0) verglichen. Die P-Werte wurden mit der Benjamini- und Hochberg-Methode angepasst.

sgRNA-Integrationen im kleinen Screen wurden mithilfe einer auf SYBR Green basierenden quantitativen PCR und Primern quantifiziert, die auf die jeweiligen sgRNA-Sequenzen abzielten (Ergänzungstabelle 4). DNA aus FACS-sortiertem EndoC-βH1 wurde wie beschrieben extrahiert. Jede Probe wurde unter Verwendung von 20 ng Gesamt-DNA und SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die Proben wurden wie für Genexpressionsexperimente beschrieben amplifiziert und analysiert.

Zum Schweigen gebrachte EndoC-βH1-Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion über Nacht in Kulturmedium mit 2,8 M Glucose ausgehungert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation in 0 mM Glucose. Die Insulinsekretion wurde durch einstündige statische Inkubation unter den angegebenen Glukose- oder Sekretagogenbedingungen eingeleitet. Der insulinhaltige Überstand wurde gesammelt und die Zellen wurden in eiskaltem saurem Ethanol lysiert, um intrazelluläres Insulin freizusetzen. Insulin wurde mit dem Insulin (human) AlphaLISA Detection Kit und dem EnSpire Alpha Plate Reader (beide Perkin Elmer) quantifiziert, basierend auf Verdünnungen von 1:10 bzw. 1:200 für den Überstand und den Insulingehalt. Intrazelluläres Proinsulin wurde mit dem Proinsulin ELISA-Kit (Mercodia) quantifiziert. Das ausgeschiedene Insulin wurde auf den Wert des intrazellulären Insulingehalts oder der Zellzahl normalisiert, der vor der Zelllyse mit dem direkten Zellproliferationstest CyQUANT (Invitrogen) gemessen wurde.

Gruppen von 15 Inseln in dreifacher Ausfertigung wurden 1 Stunde lang bei 37 °C in Krebs-Ringer-Puffer (KRB) (115 mM NaCl; 5 mM KCl; 24 mM NaHCO3; 2,5 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES (pH) vorinkubiert 7,4); 0,1 % BSA) mit 1 mM Glucose. Anschließend wurden die Inseln 1 Stunde lang in 1 mM Glucose-KRB inkubiert, gefolgt von einer 1-stündigen Stimulation in 16,7 mM Glucose-KRB. Überstände wurden entfernt und der Gesamtinsulingehalt wurde mit saurem Ethanol aus dem Inselpellet extrahiert. Die Proben wurden bei –20 °C gelagert und mittels Chemilumineszenz mit dem STELLUX Chemi Human Insulin ELISA (Alpco) auf Insulin untersucht.

Pro Spender wurden Chargen von 25 Pseudoinseln für In-vitro-Sekretionstests in RPMI 1640 (Gibco) verwendet, ergänzt mit unterschiedlichen Glucosespiegeln. Für Insulinsekretionstests wurden Pseudoinseln 1 Stunde lang bei 2,8 mM Glucose vorinkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 2,8, 5,6, 16,7 und 16,7 mM + IBMX-Glukosekonzentrationen für jeweils 60 Minuten. Für Glucagon-Sekretionstests wurden Pseudoinseln jeweils 60 Minuten lang bei 7, 1, 1 mM + 10 mM Arginin-Glucose-Konzentrationen inkubiert. Überstände wurden gesammelt und die Zellen wurden in saurem Ethanol lysiert, um den Insulin- und Glucagongehalt zu extrahieren. Humaninsulin in den Überständen und Pseudoinsellysaten wurde unter Verwendung eines Humaninsulin-ELISA-Kits (Mercodia) quantifiziert. Menschliches Glucagon in den Überständen und Pseudoinsellysaten wurde unter Verwendung eines ELISA-Kits für menschliches Glucagon (Mercodia) quantifiziert. Die ausgeschiedenen Insulin- und Glucagonspiegel werden als Prozentsatz der gDNA dargestellt, quantifiziert aus den Pseudoinsellysaten.

EndoC-βH1 wurden 1 Stunde lang bei 37 °C in Glucose-Sekretions-Assay-Puffer (SAB) (114 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,16 mM MgSO4, 25,5 mM NaHCO3, 2,6 mM CaCl2, 20 mM HEPES (pH) inkubiert 7,3), 0,2 % BSA). Nach dem Hungern wurden die Zellen 40 Minuten lang mit 0 mM oder 20 mM glukosehaltigem SAB, ergänzt mit DMSO oder 10 μM FCCP, stimuliert und in 100 μl ATP-Assaypuffer (Biovision) lysiert. Der ATP-Gehalt in den Lysaten wurde mithilfe eines luminometrischen Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers (Biovision) gemessen und auf den Gesamtproteingehalt normalisiert, der durch den BCA-Proteinassay (Pierce) bestimmt wurde.

Ganzzellige Proteinextrakte wurden aus Zellpellets durch Lyse in RIPA-Puffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS) mit 1X Proteaseinhibitorcocktail (Roche) gewonnen. . Die Proteinkonzentrationen wurden mithilfe des DC-Protein-Assays (Bio-Rad) quantifiziert. 10 μg Gesamtprotein wurden mit Probenpuffer (4 × Laemmli-Puffer (Bio-Rad), 10 % β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) gemischt und gekocht 10 Min. bei 80 °C. Denaturierte Proben wurden auf einem 4–20 %igen Criterion TGX Stain-Free Precast Gel 15 Min. lang bei 300 V in Tris-Glycin-SDS-Puffer laufen gelassen und mit dem Trans-Blot auf ein 0,2 μm Polyvinylidendifluorid übertragen Turbo Transfer System (alle Bio-Rad). Unspezifische Antikörperbindung wurde durch Inkubation mit 3 % BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Primäre Antikörperinkubationen wurden bei 4 °C durchgeführt C über Nacht, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur (Ergänzungstabelle 4). Die Blots wurden mit dem ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) abgebildet und wie beschrieben unter Verwendung von Ladungskontrollantikörpern geeigneter Größe erneut untersucht. Bild Zur Quantifizierung der Proteinbanden wurde die Lab 6.0-Software (Bio-Rad) verwendet, und die interessierenden Proteine ​​wurden auf ihre jeweilige Ladungskontrolle auf demselben Blot normalisiert.

Immunfluoreszenzanalyse im menschlichen Pankreasgewebe. Pankreata wurden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd fixiert, kryoeingebettet und Schnitte von 4 μm hergestellt. Gewebeschnitte wurden in destilliertes Wasser getaucht, 20 Minuten lang in Target-Retrieval-Lösung (Dako) gekocht, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 % PBS-Triton X-100 (Sigma-Aldrich) permeabilisiert und die unspezifische Antikörperbindung wurde mit 1 % BSA (Roche), 0,2 % fettfreie Milch, 0,5 % Triton X-100, 1 % DMSO in PBS (alle Sigma-Aldrich). Die Inkubationen mit primären Antikörpern wurden über Nacht bei 4 ° C durchgeführt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit sekundären Alexa Fluor-konjugierten Antikörpern bei Raumtemperatur (Ergänzungstabelle 4). Die Objektträger wurden mit VectaShield-Montagemedien mit DAPI (Vector Laboratories) montiert und auf einem Zeiss AxioM1 (Zeiss)-Mikroskop mit einem ×20- und ×40-Objektiv abgebildet. Zur Erstellung von Immunfluoreszenzbildern wurde die Software ImageJ 1.52b verwendet.

EndoC-βH1-Zellen wurden in Nunc Lab-Tek II-Kammerobjektträgern (Thermo Fisher Scientific) ausplattiert und mit 3 % PFA-K-PIPES und 3 % PFA-Na2BO4 für 5 bzw. 10 Minuten fixiert, gefolgt von einer Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X-100 für 30 Minuten bei Raumtemperatur (alle Sigma-Aldrich). Die Zellen wurden in einer Blockierungslösung mit 5 % Eselserum (Jackson ImmunoResearch) in PBS 30 Minuten lang inkubiert. Primärantikörper wurden in Blockierungslösung verdünnt und die Objektträger über Nacht bei 4 ° C inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit sekundären Alexa Fluor-konjugierten Antikörpern und DAPI (MP Biomedicals) bei Raumtemperatur (Ergänzungstabelle 4). Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen STELLARIS 8-Mikroskop (Leica Microsystems) durchgeführt.

Kontroll- und zum Schweigen gebrachte EndoC-βH1-Zellen wurden in 10 % Gelatine in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer (pH 7,4) bei 37 °C resuspendiert und 5 Minuten lang äquilibrieren gelassen. Die Zellen wurden pelletiert, überschüssige Gelatine entfernt, auf 4 °C abgekühlt und mit kaltem 1 %igem Osmiumtetroxid 2 Stunden lang bei 4 °C rotierend inkubiert. Sie wurden dreimal mit kaltem ultrafiltriertem Wasser gewaschen und über Nacht in 1 % Uranylacetat bei 4 °C unter Rotation en-bloc gefärbt. Die Proben wurden in einer Reihe von Ethanolwäschen (30 %, 50 %, 70 % und 95 %) jeweils 20 Minuten lang bei 4 °C dehydriert, auf Raumtemperatur äquilibriert, zweimal in 100 % Ethanol gewaschen und in Propylenoxid (PO) inkubiert ) für 15 Min. Die Proben wurden jeweils 2 Stunden lang mit EMbed-812-Harz gemischt mit PO im Verhältnis 1:2, 1:1 und 2:1 infiltriert. Sie wurden in 2:1 Harz zu PO über Nacht unter Rotation bei Raumtemperatur inkubiert, 4 Stunden lang in EMbed-812 und anschließend in Formen mit frischem Harz gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 65 °C über Nacht. Schnitte von 80 nm wurden auf mit Formvar/Kohlenstoff beschichteten 100-Mesh-Cu-Gittern aufgenommen und 30 Sekunden lang in 3,5 % Uranylacetat in 50 % Aceton gefärbt, gefolgt von 0,2 % Bleicitrat für 3 Minuten. Die Bildgebung erfolgte mit JEM-1400 120 kV (JEOL) und die Bilder wurden mit einer Gatan Orius 4k × 4k Digitalkamera aufgenommen. Die Bildquantifizierung wurde unabhängig von drei verblindeten Gutachtern durchgeführt.

Statistische Analysen wurden in Prism 8.1 (GraphPad-Software) durchgeführt. Eine Reihe biologisch unabhängiger Replikate wird als einzelne Datenpunkte angezeigt, wobei die genauen Zahlen in den jeweiligen Abbildungslegenden angegeben sind. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Signifikante Ausreißer bei primären Inselbewertungen von T2D-Risikoträgern wurden auf der Grundlage des vorab festgelegten ROUT-Ausreißertests (Q = 1 %) ausgeschlossen. Gegebenenfalls wurden Faltungsänderungen aufgezeichnet, es wurde jedoch eine statistische Analyse der logarithmisch transformierten Werte durchgeführt. Bei Bedarf, beispielsweise für bildgebende Analysen, waren die Gutachter hinsichtlich der Probenzuteilung blind. Normalverteilte Variablen wurden zwischen zwei oder mehr Gruppen mithilfe des Student-t-Tests bei zwei Stichproben oder einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest verglichen. Proben, die innerhalb eines einzelnen Replikats auf ihre jeweilige Kontrolle normalisiert wurden, wurden mithilfe eines Student-t-Tests für eine Probe analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Fastq-Sequenzierungsdateien aus dem CRISPR-Screening wurden im Europäischen Nukleotidarchiv (ENA) am EMBL-EBI unter der Zugangsnummer PRJEB44712 ​​hinterlegt. Fastq-Sequenzierungsdateien aus RNA-Sequenzierungsexperimenten für siCALCOCO2-Proben wurden im Europäischen Genom-Phänomen-Archiv (EGA) unter der Studiennummer EGAS00001006127 hinterlegt. EndoC-βh1-Expressionsdaten aus einer zuvor veröffentlichten Studie können unter PRJEB15283 (ENA)71 abgerufen werden. Die Daten stehen zum kostenlosen Download zur Verfügung, während die verarbeiteten Zählungen im Ergänzungsdatensatz 1 zu finden sind. Die RNA-seq-Daten wurden an der menschlichen Genomreferenz GRCh38 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/fasta/) ausgerichtet. homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz) und mit der Genannotation gezählt (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.101.gtf). .gz) aus der Ensembl-Datenbank heruntergeladen. Auf Quelldaten unverarbeiteter Blots und erweiterter Daten kann online zugegriffen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Quellcode von MAGeCK ist unter http://liulab.dfci.harvard.edu/Mageck frei verfügbar und die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit dem DESeq2 R-Paket durchgeführt. Der entsprechende Code ist unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7226348 verfügbar.

Mahajan, A. et al. Eine genetische Studie mehrerer Abstammungen von Typ-2-Diabetes unterstreicht die Fähigkeit verschiedener Bevölkerungsgruppen zur Entdeckung und Übersetzung. Nat. Genet. 54, 560–572 (2022).

CAS Google Scholar

Krentz, NAJ & Gloyn, AL Einblicke in die Dysfunktion der Pankreas-Inselzellen aufgrund der Genetik von Typ-2-Diabetes mellitus. Nat. Pfr. Fr. Endokrinol. 16, 202–212 (2020).

CAS Google Scholar

Dimas, AS et al. Der Einfluss von Typ-2-Diabetes-Anfälligkeitsvarianten auf quantitative glykämische Merkmale zeigt mechanistische Heterogenität. Diabetes 63, 2158–2171 (2014).

CAS Google Scholar

Thurner, M. et al. Die Integration der genomischen Daten menschlicher Pankreasinseln verfeinert die Regulierungsmechanismen an Anfälligkeitsorten für Typ-2-Diabetes. eLife 7, e31977 (2018).

Google Scholar

Mahajan, A. et al. Verfeinerung der Genauigkeit der validierten Zielidentifizierung durch Feinkartierung von Kodierungsvarianten bei Typ-2-Diabetes. Nat. Genet. 50, 559–571 (2018).

CAS Google Scholar

Udler, MS et al. Genetische Loci für Typ-2-Diabetes, die durch Multi-Merkmal-Assoziationen informiert sind, weisen auf Krankheitsmechanismen und Subtypen hin: eine Soft-Clustering-Analyse. PLoS Med. 15, e1002654 (2018).

Google Scholar

Pasquali, L. et al. Pankreas-Insel-Enhancer-Cluster, angereichert mit Typ-2-Diabetes-Risiko-assoziierten Varianten. Nat. Genet. 46, 136–143 (2014).

CAS Google Scholar

Benner, C. et al. Die Transkriptionslandschaft von Maus-Betazellen im Vergleich zu menschlichen Betazellen zeigt bemerkenswerte Artenunterschiede in der Expression langer nichtkodierender RNA und proteinkodierender Gene. BMC Genomics 15, 620 (2014).

Google Scholar

Fiaschi-Taesch, NM et al. Atlas des molekularen Zellzyklus der β-Zellen der menschlichen Bauchspeicheldrüse (G1/S). Diabetes 62, 2450–2459.

CAS Google Scholar

Henquin, J.-C., Dufrane, D., Kerr-Conte, J. & Nenquin, M. Dynamik der glukoseinduzierten Insulinsekretion in normalen menschlichen Inseln. Bin. J. Physiol. Metab. 309, E640–E650 (2015).

CAS Google Scholar

De Vos, A. et al. Menschliche und Ratten-Betazellen unterscheiden sich im Glukosetransporter, nicht jedoch in der Glukokinase-Genexpression. J. Clin. Investieren. 96, 2489–2495 (1995).

Google Scholar

Braun, M. et al. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle in menschlichen Betazellen der Bauchspeicheldrüse: elektrophysiologische Charakterisierung und Rolle bei der Insulinsekretion. Diabetes 57, 1618–1628 (2008).

CAS Google Scholar

Rorsman, P. & Ashcroft, FM Elektrische Aktivität der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse und Insulinsekretion: von Mäusen und Männern. Physiol. Rev. 98, 117–214 (2018).

CAS Google Scholar

Varshney, A. et al. Genetische regulatorische Signaturen, die der Expression von Inselgenen und Typ-2-Diabetes zugrunde liegen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 114, 2301–2306 (2017).

CAS Google Scholar

Viñuela, A. et al. Auswirkungen genetischer Varianten auf die Genexpression in menschlichen Pankreasinseln und ihre Auswirkungen auf T2D. Nat. Komm. 11, 4912 (2020).

Google Scholar

Grotz, AK et al. Eine CRISPR/Cas9-Genomeditierungspipeline in der EndoC-βH1-Zelllinie zur Untersuchung von Genen, die an der Betazellfunktion beteiligt sind. Willkommen, Open Res. 4, 150 (2019).

Google Scholar

Hastoy, B. et al. Elektrophysiologische Eigenschaften der menschlichen Betazelllinien EndoC-βH1 und -βH2 stimmen mit denen menschlicher Betazellen überein. Wissenschaft. Rep. 8, 16994 (2018).

Google Scholar

Lawlor, N. et al. Multiomisches Profiling identifiziert cis-regulatorische Netzwerke, die der Identität und Funktion menschlicher β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zugrunde liegen. Cell Rep. 26, 788–801 (2019).

CAS Google Scholar

Ravassard, P. et al. Eine gentechnisch veränderte menschliche Pankreas-β-Zelllinie, die eine glukoseinduzierbare Insulinsekretion aufweist. J. Clin. Investieren. 121, 3589–3597 (2011).

CAS Google Scholar

Andersson, LE et al. Charakterisierung der Reiz-Sekretions-Kopplung in der menschlichen Pankreas-EndoC-βH1-β-Zelllinie. PLoS ONE 10, e0120879 (2015).

Google Scholar

Krishnan, K., Ma, Z., Bjorklund, A. & Islam, MS Kalziumsignalisierung in einer gentechnisch veränderten menschlichen Betazelllinie der Bauchspeicheldrüse. Pankreas 44, 773–777 (2015).

CAS Google Scholar

Teraoku, H. & Lenzen, S. Dynamik der Insulinsekretion aus EndoC-βH1-β-Zell-Pseudoinseln als Reaktion auf Glukose und andere Nährstoff- und Nichtnährstoff-Sekretagoga. J. Diabetes Res. 2017, 2309630 (2017).

Google Scholar

Thomsen, SK et al. Typ-2-Diabetes-Risikoallele in PAM beeinflussen die Insulinfreisetzung aus menschlichen β-Zellen der Bauchspeicheldrüse. Nat. Genet. 50, 1122–1131 (2018).

CAS Google Scholar

Grant, SFA et al. Variante des Transkriptionsfaktor-7-like-2-Gens (TCF7L2) birgt Risiko für Typ-2-Diabetes. Nat. Genet. 38, 320–323 (2006).

CAS Google Scholar

Zhou, Y. et al. TCF7L2 ist ein Hauptregulator der Insulinproduktion und -verarbeitung. Summen. Mol. Genet. 23, 6419–6431 (2014).

CAS Google Scholar

Hart, T. et al. Evaluierung und Design genomweiter CRISPR/SpCas9-Knockout-Screens. Gene Genome Genet. 7, 2719–2727 (2017).

CAS Google Scholar

Li, W. et al. MAGeCK ermöglicht eine zuverlässige Identifizierung essentieller Gene aus CRISPR/Cas9-Knockout-Screens im Genommaßstab. Genombiol. 15, 554 (2014).

Google Scholar

Süssel, L. et al. Mäuse, denen der Homöodomänen-Transkriptionsfaktor Nkx2.2 fehlt, leiden an Diabetes, weil die Differenzierung der Betazellen der Bauchspeicheldrüse gestoppt ist. Entwicklung 125, 2213–2221 (1998).

CAS Google Scholar

Doyle, MJ & Sussel, L. Nkx2.2 reguliert die Betazellfunktion in der reifen Insel. Diabetes 56, 1999–2007 (2007).

CAS Google Scholar

Sansbury, FH et al. SLC2A2-Mutationen können Neugeborenendiabetes verursachen, was darauf hindeutet, dass GLUT2 möglicherweise eine Rolle bei der menschlichen Insulinsekretion spielt. Diabetologia 55, 2381–2385 (2012).

CAS Google Scholar

Abdulkarim, B. et al. Eine Missense-Mutation in PPP1R15B verursacht ein Syndrom, das Diabetes, Kleinwuchs und Mikrozephalie umfasst. Diabetes 64, 3951–3962 (2015).

CAS Google Scholar

Modi, H. et al. Die autokrine Wirkung von IGF2 reguliert die Masse und Funktion adulter β-Zellen. Diabetes 64, 4148–4157 (2015).

CAS Google Scholar

Casellas, A. et al. Die Überexpression des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 2 führt zu einer Dysfunktion der β-Zellen und erhöht die Anfälligkeit der Betazellen für Schäden. J. Biol. Chem. 290, 16772–16785 (2015).

CAS Google Scholar

Mercader, JM et al. Eine Spleißakzeptorvariante mit Funktionsverlust in IGF2 schützt vor Typ-2-Diabetes. Diabetes 66, 2903–2914 (2017).

CAS Google Scholar

Flannick, J. et al. Exomsequenzierung von 20.791 Fällen von Typ-2-Diabetes und 24.440 Kontrollen. Natur 570, 71–76 (2019).

CAS Google Scholar

Tsherniak, A. et al. Definieren einer Krebsabhängigkeitskarte. Zelle 170, 564–576 (2017).

CAS Google Scholar

Behan, FM et al. Priorisierung von Krebstherapiezielen mithilfe von CRISPR-Cas9-Screenings. Natur 568, 511–516 (2019).

CAS Google Scholar

Dempster, JM et al. Übereinstimmung zwischen zwei großen CRISPR-Cas9-Genabhängigkeitsdatensätzen für Krebserkrankungen. Nat. Komm. 10, 5817 (2019).

CAS Google Scholar

Huang, DW, Sherman, BT & Lempicki, RA Systematische und integrative Analyse großer Genlisten unter Verwendung von DAVID-Bioinformatikressourcen. Nat. Protokoll. 4, 44–57 (2009).

CAS Google Scholar

Ogata, H. et al. KEGG: Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome. Nukleinsäuren Res. 27, 29–34 (1999).

CAS Google Scholar

Szklarczyk, D. et al. STRING v11: Protein-Protein-Assoziationsnetzwerke mit erhöhter Abdeckung, die die funktionelle Entdeckung in genomweiten experimentellen Datensätzen unterstützen. Nukleinsäuren Res. 47, D607–D613 (2019).

CAS Google Scholar

Forgetta, V. et al. Ein Effektorindex zur Vorhersage von Zielgenen an GWAS-Loci. Summen. Genet. 141, 1431–1447 (2022).

CAS Google Scholar

Wissensportal zu Typ-2-Diabetes. Kuratierte T2D-Effektor-Gen-Vorhersagen. https://t2d.hugeamp.org/method.html?trait=t2d&dataset=mccarthy (2019).

Wissensportal zu Typ-2-Diabetes. Integrierte Klassifikatorvorhersagen. https://t2d.hugeamp.org/method.html?trait=t2d&dataset=manningexp (2020).

Wissensportal zu Typ-2-Diabetes. Beschleunigung des Arzneimittelpartnerschaftsprogramms – Typ-2-Diabetes. https://t2d.hugeamp.org/news.html (2020).

Greenwald, WW et al. Die Zugänglichkeit und Konformation des Pankreas-Inselchromatins zeigt distale Enhancer-Netzwerke für das Typ-2-Diabetes-Risiko. Nat. Komm. 10, 2078 (2019).

Google Scholar

van de Bunt, M. et al. Daten zur Transkriptexpression von menschlichen Inseln verknüpfen regulatorische Signale aus genomweiten Assoziationsstudien für Typ-2-Diabetes und glykämische Merkmale mit ihren nachgeschalteten Effektoren. PLoS Genet. 11, e1005694 (2015).

Google Scholar

Dupuis, J., Langenberg, C., Prokopenko, I., Saxena, R. & Soranzo, N. Neue genetische Loci, die an der Nüchternglukosehomöostase beteiligt sind, und ihre Auswirkungen auf das Typ-2-Diabetes-Risiko. Nat. Genet. 42, 408 (2010).

Google Scholar

Ingelsson, E. et al. Eine detaillierte physiologische Charakterisierung enthüllt verschiedene Mechanismen für neuartige genetische Loci, die den Glukose- und Insulinstoffwechsel beim Menschen regulieren. Diabetes 59, 1266–1275 (2010).

CAS Google Scholar

Xie, X. et al. Molekulare Grundlagen der Ubiquitin-Erkennung durch den Autophagie-Rezeptor CALCOCO2. Autophagie 11, 1775–1789 (2015).

CAS Google Scholar

Boyle, KB, Ravenhill, BJ & Randow, F. CALCOCO2/NDP52 initiiert selektive Autophagie durch Rekrutierung von ULK- und TBK1-Kinasekomplexen. Autophagie 15, 1655–1656 (2019).

CAS Google Scholar

Furuya, N. et al. NDP52 interagiert mit der mitochondrialen RNA-Poly(A)-Polymerase, um die Mitophagie zu fördern. EMBO Rep. 19, e46363 (2018).

Google Scholar

Mahajan, A. et al. Feinkartierung eines erweiterten Satzes von Typ-2-Diabetes-Loci zur Einzelvariantenauflösung mithilfe von High-Density-Imputation und inselspezifischen Epigenomkarten. Nat. Genet. 50, 1505–1513 (2018).

CAS Google Scholar

Fahie, K. & Zachara, NE Molekulare Funktionen von Glykokonjugaten in der Autophagie. J. Mol. Biol. 428, 3305–3324 (2016).

CAS Google Scholar

Marsh, SA, Powell, PC, Dell'italia, LJ & Chatham, JC Die kardiale O-GlcNAcylierung schwächt die autophagische Signalübertragung im diabetischen Herzen ab. Lebenswissenschaft. 92, 648–656 (2013).

CAS Google Scholar

Park, S. et al. Die Modifikation von O-GlcNAc ist für die Regulierung der Autophagie bei Drosophila melanogaster von wesentlicher Bedeutung. Zelle. Mol. Lebenswissenschaft. 72, 3173–3183 (2015).

CAS Google Scholar

Guo, B. et al. Die O-GlcNAc-Modifikation von SNAP-29 reguliert die Autophagosomenreifung. Nat. Zellbiol. 16, 1215–1226 (2014).

CAS Google Scholar

Twig, G. et al. Spaltung und selektive Fusion steuern die Segregation und Eliminierung der Mitochondrien durch Autophagie. EMBO J. 27, 433–446 (2008).

CAS Google Scholar

Klionsky, DJ Richtlinien für die Verwendung und Interpretation von Assays zur Überwachung der Autophagie (3. Auflage). 12, 1–222 (2016).

Gaulton, KJ et al. Eine Karte des offenen Chromatins in menschlichen Pankreasinseln. Nat. Genet. 42, 255–259 (2010).

CAS Google Scholar

Dwivedi, OP et al. Der Verlust der ZnT8-Funktion schützt durch erhöhte Insulinsekretion vor Diabetes. Nat. Genet. 51, 1596–1606 (2019).

CAS Google Scholar

Fadista, J. et al. Die globale genomische und transkriptomische Analyse menschlicher Pankreasinseln enthüllt neue Gene, die den Glukosestoffwechsel beeinflussen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 13924–13929 (2014).

CAS Google Scholar

Miguel-Escalada, I. et al. Die dreidimensionale Chromatinarchitektur der menschlichen Pankreasinseln bietet Einblicke in die Genetik von Typ-2-Diabetes. Nat. Genet. 51, 1137–1148 (2019).

CAS Google Scholar

Rai, V. et al. Einzelzell-ATAC-Seq in menschlichen Pankreasinseln und Deep-Learning-Upscaling seltener Zellen offenbaren zellspezifische regulatorische Signaturen von Typ-2-Diabetes. Mol. Metab. 32, 109–121 (2020).

CAS Google Scholar

Bonàs-Guarch, S. et al. Eine erneute Analyse öffentlicher genetischer Daten zeigt eine seltene X-chromosomale Variante, die mit Typ-2-Diabetes assoziiert ist. Nat. Komm. 9, 321 (2018).

Google Scholar

Lazarou, M. et al. Die Ubiquitinkinase PINK1 rekrutiert Autophagierezeptoren, um Mitophagie auszulösen. Natur 524, 309–314 (2015).

CAS Google Scholar

Fex, M. et al. Die pathogenetische Rolle von β-Zell-Mitochondrien bei Typ-2-Diabetes. J. Endocrinol. 236, R145–R159 (2018).

CAS Google Scholar

Heo, J.-M., Ordureau, A., Paulo, JA, Rinehart, J. & Harper, JW Der mitochondriale Ubiquitylierungsweg PINK1-PARKIN steuert ein Programm zur OPTN/NDP52-Rekrutierung und TBK1-Aktivierung zur Förderung der Mitophagie. Mol. Zelle 60, 7–20 (2015).

CAS Google Scholar

Lyon, J. et al. Forschungsorientierte Isolierung menschlicher Inseln von Spendern mit und ohne Diabetes am Alberta Diabetes Institute IsletCore. Endokrinologie 157, 560–569 (2016).

CAS Google Scholar

Lyon, J., Spigelman, AF, Fox, JEM & Macdonald, PE ADI IsletCore-Protokolle für die Isolierung, Bewertung und Kryokonservierung menschlicher Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse für Forschungszwecke V.2. https://www.protocols.io/view/adi-isletcore-protocols-for-the-isolation-assessme-x3mfqk6.html (2021).

Thomsen, SK et al. Systematische funktionelle Charakterisierung kausaler Kandidatengene für Typ-2-Diabetes-Risikovarianten. Diabetes 65, 3805–3811 (2016).

CAS Google Scholar

Nica, AC et al. Zelltyp, Allel- und genetische Signaturen im Transkriptom menschlicher Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Genomres. 23, 1554–1562 (2013).

CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

ALG ist ein Wellcome Senior Fellow in Basic Biomedical Science. AKR und SKT sind Wissenschaftler des Radcliffe Department of Medicine und AKR erhielt ein Reisestipendium von der European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD). ALG wurde vom Wellcome (200837), dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (U01-DK105535, U01-DK085545, UM1DK126185) und dem Stanford Diabetes Research Center (NIDDK-Preis P30DK116074) finanziert. Das Projekt wurde außerdem vom National Center for Research Resources (NCRR) (1S10RR026780-01) und den National Institutes of Health (NIH) (Zuschüsse R01 DK108817 und R01 DK107507 an SKK) sowie einer Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF-Stipendium) (an) unterstützt RJB). PEM wird vom Canada Research Chair in Islet Biology und teilweise von den Canadian Institutes of Health Research (MOP, 148451) unterstützt. Wir danken ehemaligen und aktuellen Mitgliedern des Gloyn-Labors für Rat und Ermutigung, Dylan Jones für die Bibliotheksamplifikation, Ruddy Montandon für die FACS-Sortierung, dem Oxford Genomics Centre (Wellcome Center for Human Genetics) für die Sequenzierung, Gene Vector and Virus Core (GVVC) für Die Erzeugung des Lentivirus mit CALCOCO2-Vektorplasmiden, der EM-Kern in der Cell Sciences Imaging Facility (CSIF) zur Vorbereitung von EM-Proben und das beschriebene Projekt wurden teilweise durch den ARRA-Preis 1S10RR026780-01 des National Center for Research Resources (NCRR) unterstützt ). Wir danken Karla Kirkegaard für die Beratung bei der LC3-Färbung. Wir danken Yan Hang, Mollie Friedlander und dem Islet Core des Stanford Diabetes Research Center für die Unterstützung bei Hormonsekretionstests. Wir danken Organspendern und ihren Familien sowie der Inselbeschaffung durch das Alberta Diabetes Institute Islet Core mit Unterstützung des Human Organ Procurement and Exchange (HOPE)-Programms, des Trillium Gift of Life Network (TGLN) und anderer kanadischer Organbeschaffungsorganisationen Integrated Islet Distribution Program (US NIH UC4 DK098085), dem National Disease Research Interchange und dem International Institute for the Advancement of Medicine. Die Familien aller Spender gaben ihre Einwilligung zur Verwendung von Bauchspeicheldrüsengewebe in der Forschung. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yingying Ye, Elena Navarro-Guerrero.

Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Radcliffe Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Antje K. Rottner, Soren K. Thomsen, Sameena Nawaz und Anna L. Gloyn

Abteilung für Pädiatrie, Abteilung für Endokrinologie, Stanford School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA

Yingying Ye, Varsha Rajesh, Alina Pollner, Jing Yang, Han Sun, Daniel Ebner und Anna L. Gloyn

Target Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Elena Navarro-Guerrero & Roberta Baronio

Abteilung für Entwicklungsbiologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Romina J. Bevacqua & Seung K. Kim

Stanford Diabetes Research Centre, Stanford School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA

Romina J. Bevacqua, Seung K. Kim und Anna L. Gloyn

Abteilung für Pharmakologie und Alberta Diabetes Institute, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada

Aliya F. Spigelman, Austin Baptist, James Lyon, Nancy Smith, Jocelyn E. Manning Fox und Patrick E. MacDonald

Oxford NIHR Biomedical Research Centre, Oxford University Hospitals Trust, Oxford, Großbritannien

Agatha Wesolowska-Andersen und Anna L. Gloyn

Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Anna L. Gloyn

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

AKR, YY, SKT und ALG haben die Studie konzipiert. AKR, EN-G. und SKT führten CRISPR-Screening-Optimierungsexperimente durch. AKR, EN-G., RB und SN führten das CRISPR-Screening durch. EN-G. und RB führte die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek durch. AKR analysierte die CRISPR-Screeningdaten. AW-A. hat zur CRISPR-Screening-Analyse beigetragen. AKR und ALG führten eine Datenintegrationsanalyse durch. AKR führte die Validierung von CALCOCO2, QSER1 und PLCB3 in Betazellen durch. AFS, AB, JL, NS, JMF, PEM und ALG bewerteten CALCOCO2-Risikoallele in menschlichen Inseln. YY, VR, AP und JY führten CALCOCO2-Folgestudien in EndoC-βH1 durch. AKR und RJB führten Inselimmunfärbungen durch. RJB, AKR und VR führten Experimente zum Knockdown von Insel-shRNA durch. HS analysierte RNA-seq-Daten. SKK, JMF, DE, PEM und ALG überwachten die Forschung. AKR und ALG haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Entwurf des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Anna L. Gloyn.

Die Autoren geben folgende konkurrierende Interessen an: AKR ist jetzt Mitarbeiter von AstraZeneca, SKT ist jetzt Mitarbeiter von Vertex Pharmaceuticals und AW-A. ist jetzt Mitarbeiter von Genomics plc. DE und EN-G sind jetzt auch XCellomics angeschlossen. Alle experimentellen Arbeiten von AKR, SKT und AW-A. wurde im Rahmen einer Anstellung an der Universität Oxford durchgeführt. AKR hält Anteile an Astra Zeneca. Der Ehegatte von ALG hält Aktienoptionen von Roche. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Genetics dankt Bridget Wagner und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Histogramme, die unterschiedliche FACS-Färbestrategien in EndoC-βH1 zeigen und intrazelluläres Insulin (blaues Diagramm) und entsprechende Isotypkontrollen (rosa Diagramm) vergleichen, wobei (a) verschiedene monoklonale Primärantikörper wie angegeben (lila, blau, rosa Antikörper) in Kombination mit einem sekundären Antikörper verwendet werden ( grau) konjugiert an AF488 (grün) oder direkte Konjugation an FITC (grün) und (b) unter Verwendung verschiedener Färbeprotokolle mit verschiedenen Fixierungs- (obere Reihe) oder Permeabilisierungspuffern (untere Reihe), wie angegeben. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und repräsentative Histogramme werden angezeigt. Das genomweite CRISPR-Screening wurde unter Verwendung des Anti-INS-Antikörpers von Cell Signaling und der kommerziellen Fixierungs- und Permeabilisierungsreagenzien und -protokolle Cytofix/Cytoperm von BD Sciences durchgeführt.

Repräsentative FACS-Bilder und Sortiertore für gefärbtes EndoC-βH1 in den genomweiten CRISPR-Screens. (a) Sortiertore zur Beurteilung der Zellgröße, Körnigkeit und Lebensfähigkeit, um Zelltrümmer auszuschließen, Singuletts und lebende Zellen zu definieren. (b) Umsortierung einer Zellpopulation mit niedrigem Insulinspiegel zur Beurteilung der Probenreinheit. SSC-A, seitlicher Streubereich; FSC-A, Vorwärtsstreubereich; FSC-W, Vorwärtsstreubreite.

(a) CRISPR-Screening-Übersicht von der ersten FACS-Sortierung des transduzierten EndoC-βH1 bis zur abschließenden Sequenzierungsanalyse. (b, c, e) Leseanzahl und kartierte sgRNA-Qualitätskontrolle für niedrige Insulinwerte (LOW1, LOW2), hohe Insulinwerte (HIGH1, HIGH2) und Referenzproben (REF1, REF2) aus beiden Replikaten, einschließlich: (b) Gesamtlesezahlen und der Anteil der kartierten Lesevorgänge und (c) die Anzahl der Null-Zählungs-sgRNAs als Anteil der gesamten sgRNAs und (e) normalisierte Lesezahlverteilungen. Die Kästchen zeigen den IQR zwischen dem ersten und dritten Quartil, die horizontale Linie zeigt den Median und die Whiskers zeigen Q3 + 1,5 × IQR und Q1 − 1,5 × IQR. (d) Hauptkomponentenanalyse der normalisierten sgRNA-Lesezahlen für die ersten beiden Komponenten mit niedrigem (grau) und hohem (blau) Insulingehalt und Referenzproben (lila) aus beiden Replikaten. (f–i) Paarweise Pearson-Korrelationsanalyse der Faltungsänderungen zwischen niedrigem und hohem Insulingehalt für jedes Replikat (f), Referenzreplikate (g), Replikate mit niedrigem Insulingehalt (h) und Replikate mit hohem Insulingehalt (i). Die violette Linie zeigt die lineare Regressionslinie an. Log2FC, log2 (Faltänderung); r, Pearson-Korrelationskoeffizient. Bei allen Daten handelt es sich um sgRNA-Reads aus zwei unabhängigen genomweiten CRISPR-Screen-Replikaten.

STRING-Signalweganalyse, die Protein-Protein-Assoziationen einschließlich physikalischer und funktioneller Interaktionen für CRISPR-Screening-Treffer zeigt. Cluster wurden manuell identifiziert, mit Anmerkungen versehen und einzeln grafisch dargestellt, und ausgewählte Cluster werden angezeigt. Das Konfidenzniveau zur Bestimmung der Interaktionen wurde auf das höchste Konfidenzniveau (0,9) eingestellt.

(a) CALCOCO2-Locus mit glaubwürdigen GWAS-Assoziationssignalen (oben) und benachbarten Genen (unten). (b–g) sgRNA-Anzahlverteilung für alle 8 sgRNAs pro Gen (4 sgRNAs pro Replikat) im genomweiten CRISPR-Screen für Gene am CALCOCO2-Locus. Veränderungen in der sgRNA-Anzahl von Proben mit niedrigem zu hohem Insulingehalt, wobei jede Farbe die gleiche sgRNA in den beiden Screen-Replikaten darstellt. Die schwarze gestrichelte Linie stellt die mittlere sgRNA-Anzahl für dieses Gen dar. (h) EndoC-βH1 wurde entweder mit Kontrollvirus und siRNA (siNT), Kontrollvirus und siCALCOCO2 oder Lentivirus stabil transduziert, um CALCOCO2 zu exprimieren, das stille Mutationen (mutCALCOCO2) beherbergt, wodurch es resistent gegen siCALCOCO2 wird (P = 0,0352). Die Daten wurden auf ihre jeweilige Kontrolle (siNT) normalisiert und mithilfe eines Ein-Stichproben-T-Tests analysiert. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus sechs unabhängigen Experimenten oder zwei unabhängigen genomweiten CRISPR-Screening-Replikaten. P-Wert * < 0,05. Keine grafische Darstellung der Signifikanz weist auf nicht signifikante Ergebnisse hin. NT, nicht zielgerichtet.

(a) Der Ansatz der Genpriorisierung kombiniert Gene mit kausalen Belegen als T2D-Effektor-Transkripte (wie im Integrationsansatz beschrieben) und stellt gleichzeitig keinen Screening-Treffer dar, hervorgehoben durch QSER1 und PLCB3. PLCB3 spielt eine Rolle im Amplifikationsweg in der Betazelle, wurde aber auch mit der Insulinwirkung in einem physiologischen Multitrait-Clustering-Ansatz in Verbindung gebracht. QSER1 wurde kürzlich als DNA-Methylierungsregulator identifiziert, der mit Pankreas-Differenzierungsdefekten assoziiert ist. (b) Veränderungen in der sgRNA-Anzahl von Proben mit niedrigem zu hohem Insulingehalt, wobei jede Farbe die gleiche sgRNA in den beiden Screen-Replikaten darstellt. Die schwarze gestrichelte Linie stellt die mittlere sgRNA-Anzahl für dieses Gen dar. (d–n) Alle Daten stammen von mit siQSER1 oder siPLCB3 behandelten EndoC-βH1 im Vergleich zu nicht zielgerichteten Kontrollzellen. (d) mRNA-Expression von QSER1 und PLCB3 in ihren jeweiligen stillgelegten Zellen (blau) im Vergleich zu siNT-Kontrollzellen (grau) (P = 0,0010, 0,0005). (e) Insulingehalt in pg pro 20.000 Zellen. (f) mRNA-Expression von INS. (g, k) Insulinsekretion normalisiert auf siNT oder (i,m) auf Insulingehalt und siNT in 1 mM, 20 mM, 1 mM + 100 μM Tolbutamid oder 20 mM Glucose + 100 μM Diazoxid. (h, j, l, n) Änderung der Insulinsekretionsfalte von 1 auf 20 mM Glucose. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus drei (d, f–n) oder 12 (e) unabhängigen Experimenten oder zwei unabhängigen genomweiten CRISPR-Screens (b, c). Die Daten wurden mithilfe des Zwei-Stichproben-t-Tests (d, h, j, l, n) und einer einfaktoriellen ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest (e, f, g, i, k, m) analysiert. Keine grafische Darstellung der Signifikanz weist auf nicht signifikante Ergebnisse hin. P-Werte *** < 0,001. FC, Faltwechsel; LFC, log2 (fache Änderung); NT, nicht zielgerichtet.

Immunfluoreszenzfärbung von mit siCALCOCO2 oder siNT behandeltem EndoC-βH1 (a) und exokrinem Gewebe in Pankreasschnitten (b). Die Schnitte wurden doppelt auf INS und CALCOCO2 immungefärbt (rot oder grün, wie angegeben). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 6 μm (a) oder 10 μm (b). d: Duktuszellen; a: Azinuszellen; ich: Insel. NT, nicht zielgerichtet. Alle Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Immunfluoreszenzfärbungen.

Alle Daten stammen von mit siCALCOCO2 behandelten EndoC-βH1 im Vergleich zu nicht zielgerichteten Kontrollzellen. (a–d, g, h, k–m) mRNA-Expression der angegebenen Zielgene, gemessen in RNA-Seq (a–d, k–m) oder qPCR (g, h) mit ihren jeweiligen stillgelegten Zellen (blau) im Vergleich zu siNT-Kontrollzellen (grau) (P = 1,87 × 10−6). (e, f) Quantifizierung veränderter Mitochondrien in EM-Bildern basierend auf abnormaler Form oder Cristae, normalisiert auf die Gesamtzahl der Mitochondrien durch verblindete Prüfer zwei und drei (P < 0,0001, 0,0032). (i, j) Quantifizierung reifer Insulinkörnchen normalisiert auf die Gesamtzahl der Körnchen pro Zelle in EM-Bildern durch verblindeten Prüfer zwei und drei (P = 0,0002, 0,0002). (n, o) Proteingehalt von PCSK1 (n), PCSK2 (o) und seiner Ladungskontrolle GAPDH. (p, q) Quantifizierung des Western-Blot-Proteinspiegels von PCSK1 (p) und PCSK2 (q), normalisiert auf GAPDH- und siNT-Kontrollzellen. r,s) Insulin- (r) oder Proinsulingehalt (s) nach Behandlung mit MG132 bei 1 μM (+), 10 μM (++) oder DMSO im Vergleich zu siNT-Kontrollzellen (gepunktete Linie). Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten oder mindestens sechzehn Zellen, gemessen von drei unabhängigen Gutachtern (e, f, i, j). Der Proteingehalt wird als Prozentsatz von siNT angezeigt, der bei 100 % als gepunktete Linie hervorgehoben ist. Die Daten wurden mithilfe des T-Tests bei zwei Stichproben (e–j), des Wald-Tests in DESeq2, angepasst mit der Methode von Benjamini und Hochberg (a–d, k–m), des T-Tests bei einer Stichprobe (p, q) und eines T-Tests bei einer Stichprobe (p, q) analysiert -Wege-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest (r, s). Keine grafische Darstellung der Signifikanz weist auf nicht signifikante Ergebnisse hin. P-Werte ** < 0,01, *** < 0,001, **** < 0,0001. NT, nicht zielgerichtet.

Quelldaten

Ergänzende Tabellen 2 und 3, Methoden und Diskussion.

Ergänzende Tabelle 1 – Bildschirmaufrufe. Ergänzende Tabelle 2 – Priorisierte kausale Gene für T2D basierend auf der Integration mit T2D-Effektorgenvorhersagen. Ergänzende Tabelle 3 – Details zu menschlichen Gewebespendern. Ergänzende Tabelle 4 – Ressourcen. Ergänzungstabelle 5 – RNA-seq. Ergänzende Tabelle 6 – Inselspender. Ergänzende Tabelle 7 – sgRNA-Treffer. Ergänzende Tabelle 8 – Screen_all sgRNA.

Unverarbeitete Western Blots.

Unverarbeitete Western Blots.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rottner, AK, Ye, Y., Navarro-Guerrero, E. et al. Ein genomweites CRISPR-Screening identifiziert CALCOCO2 als Regulator der Betazellfunktion, der das Risiko für Typ-2-Diabetes beeinflusst. Nat Genet 55, 54–65 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

Zitat herunterladen

Eingegangen: 21. Mai 2021

Angenommen: 26. Oktober 2022

Veröffentlicht: 21. Dezember 2022

Ausgabedatum: Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Experimentelle und Molekulare Medizin (2023)

Naturgenetik (2023)